巴西固氮螺菌Yu62glnB基因的克隆及其功能分析

摘要

通过原位杂交人巴西固氮螺菌Yu62的基因文库中,筛选到glnB基因的阳性克隆,将3.7kb/EcoRⅠ+PstⅠ的阳性克隆亚克隆到pUC19中,进行了全序列分析,其在GenBank中的登记号是AF323960.DNA序列分析表明该阳性克隆含有完整的glnB基因,glnB基因下游是编码谷氮酰胺合成酶(GS)的glnA基因,glnB基因上游是一个编码未知蛋白的ORF.glnB基因编码区长336bp,编码112个氨基酸,与肺炎克氏杆菌、大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌及大肠杆菌在氨基酸顺序的同源性分析高达71﹪,77﹪,79﹪和69﹪.将卡那霉素抗性片段(Km-cassette)插入glnB基因的BglⅡ位点,通过三亲杂交法将其引入到巴西固氮螺菌Yu62中,通过同源重组,获得GlnB突变株(glnB:Km).为了进一步分析,glnB基因的功能,将glnB基因的编码区(339bp)构建在pVK100中,置于Km启动子下组成型表达,形成重组质粒pVK-Ⅱ.将重组质粒pVK-Ⅱ转入到glnB<'->突变株,构建成互补株C-glnB(glnB::Km/glnB).对glnB<'->突变株和互补株的固氮酶活性.突变株、互补株及野生型在菌落生长速度上基本相同.将含有glnB基因的重组质粒pVK-Ⅱ分别转移到野生型Yu62菌株和具有一定抗铵能力的DraT<'->突变株中,使glnB基因的拷贝数增加,并进一步比较它们的固氮酶活性,结果表明多拷贝的glnB基因能显著提高固氮酶活性.