巴西固氮螺菌RpoD基因克隆表达及功能分析

摘要

转录调控是分子生物学领域中研究最广泛的调控机制之一，而RNA聚合酶全酶（RNAP）在该机制中发挥着主要的作用。它主要包含核心酶与sigma因子两个组成成分，能够特异结合启动子从而开始进行转录。其中，Sigma因子特异识别启动子元件并促进起始转录的进行。Sigma因子不仅是RNAP的一个独特亚基，而且也是信号转导系统的重要组成部分，其作为主调控因子，调控多个生物代谢过程。RpoD蛋白属于sigma因子家族成员蛋白，在微生物的生长发育、生物代谢以及一些胁迫应答调控中发挥着重要的作用。　　本研究利用巴西固氮螺菌（Azospirillum. brasilense Az39、Azospirillum. brasilense Sp7）、产脂固氮螺菌（Azospirillum. lipoferum 4B）、腐质霉固氮螺菌（Azospirillum. humicireducens SgZ-5）、固氮螺菌（Azospirillum sp.B510）、喜硫固氮螺菌（Azospirillum. thiophilum BV-S ）这6个已经完成基因组测序的固氮螺菌基因组，经比对得到RpoD基因保守序列，并以巴西固氮螺菌L25的DNA为模板，对RpoD基因序列进行了克隆及其验证、在大肠杆菌BL21体内进行了表达以及碳源利用功能分析和一些耐受胁迫能力分析。此外，为构建RpoD-GFP融合蛋白表达载体，以质粒pCR2.1-TOPO-GFP为模板，对绿色荧光蛋白基因GFP进行了克隆、验证及表达。获得以下结果：　　1、克隆得到的RpoD基因，其全长为1959 bp，且编码653个氨基酸，具有一个sigma70家族的保守结构域，属于sigma因子中sigma70蛋白家族成员的第一类基础sigma因子；系统进化树分析显示，L25菌的RpoD基因与其同属的巴西固氮螺菌来源的亲缘关系最近；将该基因插入表达载体pET-32a（+）上，构建得到pET-32a-RpoD重组质粒。　　2、外源RpoD基因在大肠杆菌BL21体内诱导表达经SDS-PAGE检测，在约100 KD处有一条明显亮带，得到pET-32a（+）载体部分序列与目的基因的融合蛋白，说明外源RpoD基因在大肠杆菌体内成功表达。　　3、外源RpoD基因在大肠杆菌BL21体内的碳源利用功能分析表明：外源基因RpoD在大肠杆菌BL21体内的表达，使菌体对碳源的利用种类明显增多，且对其中有些碳源的利用能力增强，但同时对少数几类碳源的利用能力减弱甚至消失。　　4、外源RpoD基因对大肠杆菌BL21耐受胁迫因子的响应功能分析表明：含外源RpoD基因的大肠杆菌BL21在高温、高渗透压、氧化、IPTG以及酸性等胁迫环境下，其耐受胁迫和生长情况较不含外源RpoD基因的对照菌大肠杆菌BL21差异显著。其中，在高温、IPTG等胁迫条件下，外源RpoD基因的表达对大肠杆菌BL21耐受胁迫能力起促进作用；而在氧化、酸性以及高渗透压等胁迫下，外源RpoD基因的表达对大肠杆菌BL21耐受胁迫能力既有促进也有抑制作用。　　另外，克隆得到绿色荧光蛋白基因 GFP ，并成功构建得到重组质粒pET-32a-RpoD-GFP；利用诱导剂IPTG对含该重组质粒的大肠杆菌BL21进行诱导表达，得到含有pET-32a-RpoD-GFP重组质粒的浅绿色菌株，说明GFP基因在大肠杆菌体内成功表达，此结果有助于后续RpoD基因转入固氮菌体进行筛选与鉴定。　　以上试验结果说明RpoD蛋白是一类能够对外界胁迫环境进行响应，同时也能调节和控制宿主菌某些代谢途径的全局调控因子，为RpoD基因在固氮菌或其他功能菌株中的耐胁迫能力以及一些生物功能的深入研究奠定基础。

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1 前言

1.1植物内生固氮菌概述

1.1.1植物内生固氮菌的作用

1.1.2固氮螺菌的概述及其功能作用

1.2 Sigma因子概述

1.2.1 Sigma因子的分类

1.2.2 Sigma因子的结构特点

1.2.3 Sigma因子的作用机制

1.2.4 Sigma因子的生物功能

1.2.5 Sigma因子与生物固氮

1.2.6 RpoD的生物功能

1.3 GFP报告基因概述

1.3.1 GFP蛋白的发光机制

1.3.2 GFP的优点及功能应用

1.4 转化方法

1.4.1 化学转化法

1.4.2 电转化方法

1.4.3 三亲杂交法

1.5 研究目的和意义

1.6 技术路线

2.1材料

2.1.1 菌株及载体

2.1.2 培养基、试剂及抗生素

2.1.3 酶及相关试剂盒

2.1.4 实验仪器

2.2 方法

2.2.2 巴西固氮螺菌DNA提取及质粒pET-32a的提取

2.2.3 PCR引物设计及PCR扩增sigma因子

2.2.4 重组质粒载体构建

2.2.5 RpoD基因的序列分析

2.2.6 重组载体转化至大肠杆菌BL21并在其体内的诱导表达

2.2.7 外源基因在大肠杆菌体内的功能研究

2.2.8 GFP报告基因插入重组质粒

3.1 Sigma因子-RpoD基因的克隆和表达

3.1.1 RpoD基因的扩增和鉴定

3.1.2 重组质粒pET-32a-RpoD构建示意图

3.1.3 重组质粒PCR及双酶切验证

3.1.4 RpoD基因在大肠杆菌BL21中的表达

3.2 Sigma因子生物信息学分析

3.2.1 sigma因子同源保守序列分析

3.2.2 sigma因子—RpoD蛋白系统发育分析

3.3 外源基因在大肠杆菌体内的功能检测

3.3.1 碳源利用差异分析

3.3.2 外源RpoD基因对大肠杆菌生长影响分析

3.3.3 外源RpoD基因对大肠杆菌耐受IPTG的影响

3.3.4 外源RpoD基因对大肠杆菌耐受高温的影响

3.3.5 外源RpoD基因对大肠杆菌耐受氧化胁迫的影响

3.3.6 外源RpoD基因对大肠杆菌耐受酸胁迫的影响

3.3.7 外源RpoD基因对大肠杆菌耐受高渗胁迫的影响

3.4 GFP报告基因插入重组质粒pET-32a-RpoD

3.4.1 GFP基因的PCR扩增和鉴定

3.4.2 重组质粒pET-32a-RpoD-GFP构建示意图

3.4.3 重组质粒pET-32a-RpoD-GFP的PCR验证

3.4.4 含有重组质粒pET-32a-RpoD-GFP的大肠杆菌菌体形态鉴定

4 讨论与分析

4.1 RpoD基因的克隆及表达载体构建

4.2 RpoD基因在大肠杆菌中的诱导表达

4.3 外源RpoD基因的表达对大肠杆菌碳源利用的影响

4.4 外源RpoD基因的表达对大肠杆菌应激胁迫的影响

4.5 GFP基因的克隆和载体pET-32a-RpoD-GFP构建

5 结论

6 展望

致 谢

时间过得很快，马上就要结束硕士研究生学习生涯。此时此刻，我要特别衷心地感谢导师谭志远。

本研究论文从一开始的选题，以及后面的实验进行，再到毕业论文的撰写，谭老师精心和耐心的指导，以及他渊博

硕士生涯过得很充实、很开心。要特别感谢实验室的杨美艳老师对我学习上的帮助和生活上的关心，以及实验室管

最后，我要感谢我的家人和朋友，生活上和学习上都给予我最无私的关怀、支持和鼓励，给予了我不断前进的信心

参 考 文 献

附 录