重组双功能水蛭素的发酵、纯化和鉴定

摘要

目的:建立功能水蛭素(recombinant-RGD-Hirudin、r-RGD-Hirudin)的制备方法.方法:构建了重组双功能水蛭素cDNA的表达质粒RGD-Hirudin-pPIC9K,转化入毕赤酵母中,经筛选得到高表达的阳性克隆.结果:种子菌经过三天发酵培养,其培养液上清经超滤浓缩,凝胶过滤层析,离子交换层析后,得到纯度大于97﹪,比活性为12000ATU/mg的r-RGD-Hirudin,回收率大于60﹪,发酵产率为1g/L.结论:纯化后的r-RGD-Hirudin经过还原SDS-PAGE、抗凝血酶活力分析、抗血小板聚集分析、质谱分析及等电聚焦分析等方法鉴定,证明该表达产物为水蛭素的衍生物,具有抗凝血酶和抗血小板聚集双重功能.