重组葡激酶-水蛭素融合蛋白工程菌的高密度发酵及其表达产物的分离纯化、二聚体分析及与凝血酶相互作用的研究

摘要

目的：溶栓与抗凝药物联合疗法是当前血栓相关性疾病的重要临床治疗方案。重组SFH是葡激酶(SAK)和水蛭素(HV)通过一个Xa因子连接起来的融合蛋白，编码该融合蛋白的重组基因插入温控型表达载体pBV220，转化感受态大肠杆菌，筛选出大肠杆菌工程菌株用来大量生产SFH。通过体内和体外药效学试验证明，融合蛋白SFH有着良好的溶栓和抗凝双功能，出血倾向大为降低，且有一定的血栓靶向性，效果优于SAK和HV联合用药，因而有着广泛的应用前景。但是SFH大肠杆菌工程株在低密度发酵的情况下，目的蛋白产量不到100mg/L，不能满足临床溶栓治疗大量用药的要求，而成为推广应用的瓶颈。因而通过对大肠杆菌进行高密度发酵来提高单位体积的目的蛋白产率也就成为大规模生产融合蛋白SFH的当务之急。 发酵产物的分离纯化是一个药物蛋白生产中比较棘手的问题，由于每种蛋白的性质不一样，如等电点、分子量大小、疏水性、极性、亲和性等，所以相应的分离纯化工艺也就不一样，需要反复的实验与探索。 已知HV存在两个结构域：与凝血酶相互作用的C端结合结构域和N端的催化结构域。发色底物(S-2251)法实验说明融合蛋白SFH失去了抗凝活性，即在水蛭素N端连接的SAK封闭了HV的N端的催化结构域，但可能仍保留有C端的与凝血酶结合的结合结构域功能，这是融合蛋白血栓靶向功能的基础。 方法与结果：通过结合前人的研究经验，采用易于控制的溶氧反馈的分批补料的培养方法高密度发酵重组大肠杆菌BL21(DE3)生产SFH融合蛋白。通过摇瓶培养对菌种和pH的筛选，采用溶氧反馈的流加补料策略，进行了5L发酵罐的合成培养基和复合培养基的发酵工艺的研究。通过对培养条件的不断优化，重组葡激酶一水蛭素融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)里得到了高效表达，菌体密度最终达到80OD600左右，菌体湿重达到115g/L以上，可溶性重组融合蛋白占菌体总蛋白的30％以上，含量约为1.2-1.3g/L，较优化前的目的蛋白表达量提高了10倍以上。5L发酵罐的发酵工艺参数在40L发酵罐中进行了放大培养，结果表明该工艺能有效的放大，可适用于工业生产。 本试验中通过对发酵后菌体的反复冻融提取目的蛋白，经多次实验后，选择采用离子交换和凝胶过滤层析对融合蛋白进行了分离纯化，纯化后回收的目的蛋白占总蛋白的20％，5L发酵罐发酵可获得纯品约720mg/L。经反相高效液相色谱(RP-HPLC)和变性聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)检测后，蛋白纯度达到98％以上。 在融合蛋白纯化过程中，发现了融合蛋白的同源二聚体，而且在溶液中还存在可逆的蛋白自我二聚化的行为，经疏水色谱(HIC)、高效排阻色谱(HPSEC)和MALDI-TOF分析，证明了二聚体的存在和可逆的自我交联行为。蛋白同源二聚体的形成大部分原因是由于疏水作用和静电相互作用的结果，同时与盐浓度、温度、pH等都有关系，本试验中利用HPSEC和HIC对其可能的形成原因进行了分析，认为SFH同源二聚化大部分原因系疏水相互作用所致。 由于该二聚体的存在能导致融合蛋白纯化得率的降低和临床使用过程中免疫源性的增加以及药品报批过程中质检方面的问题，所以对溶液中同源二聚体的形成必须加以控制。甘露醇是通常用来在药物保存过程中作为一种赋形剂和表面活性剂的小分子物质，在本试验中意外的发现它能有效的阻止同源二聚体的生成，这可能与自由基的消除有关，至于具体的原因，尚有待进一步的研究。 本文利用酶联免疫吸附反应(ELISA)方法体外检测了融合蛋白SFH和凝血酶的相互作用，并存在一定的剂量关系，证明了融合蛋白SFH和凝血酶的相互作用，表明该融合蛋白在体内可能存在一定的血栓靶向性。

目录

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英文缩略词表

前言

第一部分重组葡激酶-水蛭素大肠杆菌的高密度培养

第二部分重组葡激酶-水蛭素的分离纯化及二聚体分析、与凝血酶相互作用研究

总结

参考文献

文献综述 重组大肠杆菌高密度培养及其产物的分离纯化

致谢

附录 硕士期间发表的论文