蛛丝蛋白工程菌高密度发酵、表达产物纯化与湿法纺丝

摘要

蜘蛛丝尤其是由蜘蛛大囊状腺产生的拖丝,具有质地轻、富有弹性、强度高等优良的特性,作为生物材料具有广泛的应用前景,基因工程技术为大规模生产蛛丝蛋白提供了可能途径.该论文研究了重组蛛丝蛋白工程菌的发酵培养与重组蛛丝蛋白的纯化工艺,并制备了重组蛛丝蛋白纺丝液,进行了湿法纺丝的尝试,在国内首次报道了利用重组蛛丝蛋白进行纺丝并测定了纤维的部分性能.研究了重组质粒pNS2在两种宿主菌中的摇瓶与10L发酵罐培养表达情况,确定了较适的宿主菌为BL21(DE3),采用pH-stat补料分批发酵,工程菌pNS2/BL21(DE3)最终菌体密度OD<,600>达71.64,表达量为0.8g/L.重组蛋白以可溶性的形式表达,等电聚焦电泳测定其等电点为8.5,通过超声破碎细胞,调节pH5.6,55~60℃加热4min,20％饱和(NH<,4>)<,2>SO<,4>沉淀等步骤,重组蛋白的纯度可达92%,回收率达57.5%.建立了简单、高效的规模纯化工艺.纯化的蛋白经透析及冷冻干燥后,选择甲酸作为制备纺丝液的溶剂,制备浓度大于10%的纺丝液,初步研究了湿法纺丝工艺的影响因素,测定分析了三种不同湿法纺丝工艺纺成的丝纤维的水溶性、密度、比强度等物理和机械特性.合成了不溶于水且具有一定强度的纤维.分析认为纺丝液的浓度、凝固浴组成与浓度、拉伸对丝纤维的物理与机械性能均有影响.控制湿法纺丝过程的参数可人工合成具有一定特殊性能的纤维.

目录

文摘

英文文摘

序言

1蜘蛛丝的研究进展

1.1蜘蛛丝的种类与性质

1.2蜘蛛丝的力学特征

1.3蜘蛛丝的分子结构

1.4蜘蛛丝的分子结构与力学性能之间的关系

1.5蛛丝蛋白的基因工程研究进展

1.6人工蛛丝纤维的研究

1.7蜘蛛丝的应用前景

2大肠杆菌高密度培养

2.1影响大肠杆菌高密度发酵的主要因素

2.2大肠杆菌补料高密度发酵

3本研究的背景、意义与路线

3.1蛛丝蛋白研究目前存在的问题

3.2本研究的背景材料

3.3本研究的技术路线

3.4本研究的意义

第一部分pNS2/BLR(DE3)的发酵培养与重组蛛丝蛋白的纯化

1材料

1.1菌株

1.2主要试剂

1.3仪器与设备

1.4培养基与主要溶液

2方法

2.1工程菌的摇瓶培养

2.2工程菌的10L发酵罐培养

2.4重组蛛丝蛋白的分离纯化

3结果

3.1工程菌的生长及重组蛋白表达规律

3.2补料分批发酵表达重组蛛丝蛋白

3.3重组蛛丝蛋白的分离纯化

4 讨论

4.1高密度发酵

4.2分离纯化

第二部分pNS2/BL21(DE3)的高密度发酵与重组蛛丝蛋白的纯化

1材料

1.1菌株

1.2主要试剂

1.3仪器与设备

1.4培养基与主要溶液

2方法

2.1构建pNS2/BL21(DE3)plysS工程菌

2.2构建pNS2/BL21(DE3)工程菌

2.3 pNS2/BL21(DE3)工程菌的高密度发酵

2.4重组蛋白的分离纯化

3结果

3.1 pNS2重组质粒的制备

3.2 pNS2在BL21(DE3)plysS中的表达与鉴定

3.3 pNS2在BL21(DE3)中的表达与鉴定

3.4 pH-stat补料分批发酵表达重组蛛丝蛋白

3.5重组蛛丝蛋白的规模分离纯化

4讨论

4.1 pNS2在三种宿主菌中的表达

4.2高密度发酵

4.3分离纯化

第三部分重组蛛丝蛋白湿法纺丝的初步研究

1材料

1.1试剂

1.2仪器

2方法

2.1重组蛛丝蛋白在不同溶剂中的溶解性

2.2纺丝液的制备

2.3丝纤维的成形与拉伸

2.4丝纤维性能分析方法

3结果

3.1重组蛋白的溶解性

3.2影响湿法纺丝的因素

4讨论

4.1重组蛋白溶解性与纺丝液的制备

4.2丝纤维的成形与性能

结论与今后研究设想

参考文献

英文缩略词中英文对照表

在学期间发表论文及专利申请情况

致谢

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