人工接头和Loop 7在重组单链钙调磷酸酶中的功能

摘要

钙调磷酸酶(CNorPP-2B)属于包括蛋白磷酸酶-1(PP-1)和蛋白磷酸酶-2A(PP-2A)在内的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族,是这个家族中唯一一种受钙调素调节的磷酸酶.它由催化亚基A(CNA)和调节亚基B(CNB)按1∶1的比例组成全酶分子,酶的结构从酵母到人都是保守的.生化和遗传研究鉴定A亚基由四个功能上截然不同的结构域--催化结构域、B亚基结合结构域、钙调素结合结构域和一个自抑制结构域组成.晶体结构显示,催化结构域含有一个双金属催化中心口袋,β12与β13之间的loop7位于底物进入活性位点的隧道口.基于loop7在结构上的特点,本文对其进行了定点缺失,研究loop7在逐渐缩短过程中的活性变化和受钙调素调节能力的改变.本文利用一对含有6个甘氨酸密码子的接头引物扩增了B亚基与A亚基及其缺失突变体(V314、V314Y315、D313V314Y315)的融合基因,构建了单链型全酶的高校表达体,并且纯化了这四种单链型全酶.以相似方法制备了不含柔性接头的单链型全酶,以探讨接头对酶活性的影响.