Wortrnannin通过磷脂酰肌醇激酶3和肌球蛋白轻链激酶以外的信号途径导致斑马鱼“双心畸形”

摘要

“双心畸形”是一种常见的先天性心脏畸形，斑马鱼大规模的遗传筛选发现特定的基因突变可导致斑马鱼“双心畸形”，本研究发现不仅遗传因素可导致斑马鱼“双心畸形”，环境中一些化合物的存在同样可导致斑马鱼“双心”突变。Wortmannin是一种真菌代谢产物，可结合磷脂酰肌醇教酶3(PI-3-K)和肌球蛋白轻链激酶(MLCK)，抑制PI-3-K及MLCK的活性.在斑马鱼胚胎生存的水环境中人为地加入不同浓度的wortmannin，胚胎发育至48h时可见“双心”斑马鱼.为证明双心是否含有独立的心房及心室，用amhc(心房特异性肌球蛋白重链)和vmhc(心室特异性肌球蛋白重链)作为分子探针进行胚胎整体原位杂交实验，结果证明双心含有独立的心房及心室.进一步原位免疫荧光实验证明双心含有分化成熟心肌的特异蛋白质。一系列暴露实验显示水环境中wortmannin的浓度与斑马鱼胚胎的“双心”发生率呈明显的剂量一效应关系，16μM wortmannin能导致60％的胚胎产生“双心”。通过在胚胎发育不同时间点加入或洗去wortmamn，本研究证明导致“双心”产生的关键时闻窗为受精后6h到16h。Wortmannin能特异性抑制PI-3-K及MLCK的活性，因此，worunannin有可能通过抑制PI-3-K和(或)MLCK的活性导致“双心”突变体的产生.为验证抑制PI-3-K和(或)MLCK的活性是否足够能导致“双心”突变体的产生，在斑马鱼胚胎生存的水环境中人为地加入不同浓度的另一种PI-3-K和(或)MLCK的抑制剂，水环境中PI-3-K和(或)MLCK的抑制剂浓度即使高达64 μM也不能产生“双心”突变。所以wortmannin导致“双心”并非通过PI-3-K和(或)MLCK的通路.本研究正运用分子毒理学、分子生物学和发育遗传学手段，进一步阐明Wortmannin导致斑马鱼“双心畸形”的分子机理.