磷脂酰肌醇3激酶信号途径在血小板源生长因子诱导肝星状细胞增殖与Ⅰ型胶原合成中的作用

摘要

研究背景 肝纤维化本质上是肝脏对各种慢性损伤的创伤愈合反应。肝纤维化中细胞外基质的量和类型都发生了变化，其特征性的病理改变是以Ⅰ型胶原为主的细胞外基质蛋白在肝内过度沉积。过度沉积的细胞外基质改变了正常的肝内结构并最终导致肝功能障碍。 肝星状细胞(HSC)是肝纤维化过程中细胞外基质的主要生成者，研究表明在肝纤维化中其增殖活性和Ⅰ型胶原的合成能力大大提高。因此，有效地减少HSC合成胶原，抑制细胞的增殖将会减缓肝纤维化的形成。HSC的激活是肝纤维化发生发展过程中的重要事件，并受多种细胞因子的调节。血小板源生长因子(PDGF)是HSC最强的有丝分裂原。PDGF能明显促进HSC的增殖，但是否也促进HSC合成Ⅰ型胶原目前报道不一。PDGF通过磷脂酰肌醇3激酶(P13K)信号途径发挥促细胞增殖作用，这在其他细胞中研究较多，但该通路在HSC的作用报道不多。肝纤维化中信号通路的研究目前比较关注，本研究试图从细胞信号角度进一步了解纤维化形成的机制。 第一部分 目的：研究PDGF-BB对HSC细胞增殖以及合成Ⅰ型胶原的作用 方法：大鼠的HSC细胞用不同浓度的PDGF-BB培养处理，收集细胞和培养液上清。细胞增殖用MTT法检测，流式细胞仪检测细胞周期，Ⅰ型胶原蛋白用ELISA法检测，RT-PCR法检测Ⅰ型胶原mRNA的表达。 结果：PDGF-BB在浓度1～10ng/ml时呈剂量依赖性地促进HSC细胞增殖，当浓度大于10ng/ml其促增殖作用达到饱和。PDGF-BB明显促进细胞的DNA的合成，使细胞大部分处于S期。PDGF-BB能在蛋白和mRNA水平上促进Ⅰ型胶原的合成，并且随着PDGF-BB处理时间地延长其合成量也增加。 第二部分 目的：研究磷脂酰肌醇3激酶(P13K)特异性的抑制剂LY294002对PDGF诱导的肝星状细胞增殖与Ⅰ型胶原合成的影响，并初步探讨P13K信号通路在PDGF诱导肝星状细胞活化中的机制。 方法：HSC细胞用LY294002和PDGF-BB共同孵育处理。收集细胞和培养液上清。细胞增殖用MTT法检测，Ⅰ型胶原蛋白用ELISA法检测，RT-PCR法检测Ⅰ型胶原mRNA的表达。利用P13K通路下游效应物AKT作为活化指标，ELISA法检测AKT和磷酸化AKT蛋白的表达。 结果：5、10、251xmol/1的LY294002均能显著且剂量依赖性地抑制PDGF-BB刺激的HSC-T6增殖。LY294002能抑制PDGF-BB诱导的HSC细胞合成Ⅰ型胶原。PDGF-BB能激活P13K通路，并导致AKT磷酸化。抑制P13K通路可以抑制PDGF-BB对HSC细胞的促增殖作用并减少Ⅰ型胶原的合成。 结论 PDGF能够促进HSC的增殖，同时也促进其Ⅰ型胶原的合成。PDGF激活HSC是通过P13K信号通路，其作用可以被P13K抑制剂所抑制。P13K是PDGF诱导HSC细胞增殖过程中重要的细胞信号通路，同时也调节Ⅰ型胶原的合成。对该通路的进一步研究将会对抗纤维化治疗提供新的思路。

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第一部分血小板源生长因子对肝星状细胞增殖和Ⅰ型胶原合成的影响

第二部分磷脂酰肌醇3激酶信号途径对血小板源生长因子促肝星状细胞增殖与Ⅰ型胶原合成的影响

综述肝星状细胞的活化与肝纤维的形成

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