白藜芦醇和紫檀芪经由AMPK-ERK5-KLF2轴刺激MnSOD表达和延缓血管内皮细胞衰老

摘要

目的:伴随着衰老,锰超氧化物歧化酶(MnSOD)mRNA表达水平趋向降低,同时增加线粒体氧化应激和线粒体功能障碍.一些研究表明,MnSOD缺失也加剧年龄增加相关的血管功能障碍.白藜芦醇和紫檀芪是从龙血竭、虎杖中分离到的化合物,可以减轻线粒体氧化应激,然而,其作用机制尚不清楚.本研究试图探讨这2个不同芪类诱导MnSOD表达的分子机制.rn 方法:对MnSOD表达活性的评估是由自行构建的MnSOD启动子(766-+90)荧光素酶报告基因质粒实施的。使用MitoSOXTM Red荧光探针测定线粒体氧化应激。实时定量PCR检测mRNA的表达。免疫印迹检测蛋白表达和磷酸化水平。AMPK,ERK5和HDAC5的表达沉默使用ShRNA进行。利用染色质免疫沉降-实时定量PCR方法测定KLF2在MnSOD启动子上的结合能力。rn 结果:1、白藜芦醇和紫檀芪延缓血管内皮细胞的衰老与线粒体氧化应激。使用酸性β-半乳糖昔酶染色，发现白藜芦醇和紫檀芪能够呈剂量依赖性降低内皮细胞衰老的数量。应用线粒体氧化应激探针MitoSOXTM ReD与血管内皮细胞孵育后，用血管紧张素Ⅱ刺激内皮细胞，诱导线粒体氧化应激。结果表明，白藜芦醇和紫檀芪能显著抑制血管紧张素Ⅱ诱导的线粒体氧化应激。2、白藜芦醇和紫檀芪诱导MnSOD和线粒体功能相关基因的表达。构建了一个人类MnSOD基因启动子(766-+90)的荧光素酶报告质粒，以此检测白藜芦醇和紫檀芪诱导MnSOD表达能力。白藜芦醇或紫檀芪诱导荧光素酶报告质粒的活性在以剂量依赖的(1-40μM )，白藜芦醇和紫檀也增加MnSOD mRNA和蛋白的表达，以及其他线粒体功能相关基因的诱导表达，如Klf2,MCAD,CytC,PDK4和PGCa-l。3、白藜芦醇和紫檀芪诱导LKB1,AMPK,ERK5和HDAC5磷酸化和KLF2的表达。内皮细胞与白藜芦醇或紫檀芪孵育8小时，发现白藜芦醇和紫檀芪显著增加LKB1,AMPK,ERK5、HDAC5的磷酸化，而用ShRNA沉默AMPK,ERK5,HDAC5表达可以减弱白藜芦醇或紫檀芪诱导MnSOD表达。4、白藜芦醇和紫檀芪促进KLF2转录因子与MnSOD启动子DNA的结合。在MnSOD启动子的-500以内序列中存在两个KLF2结合位点的CACCC片段序列。使用染色质免疫共沉降-定量PCR联用方法，显示白藜芦醇和紫檀芪增强KLF2与MnSOD启动子DNA的结合能力有1.5倍以上。rn 结论:结果表明，白藜芦醇和紫檀芪能够改善血管内皮细胞衰老，降低线粒体氧化应激。这2个芪类化合物能够刺激LKB1和AMPK磷酸化，并进一步激活ERK5和HDAC5磷酸化和促进KLF2表达。这2个芪类化合物也提升MnSOD启动子荧光素酶报告基因的活性、mRNA和蛋白质表达水平，而沉默AMPK,ERK5和HDAC5的表达可以阻止这2个芪类化合物对MnSOD的表达诱导作用。结果显示出白藜芦醇和紫檀芪延缓血管内皮细胞衰老的一种新机制。