SPHK1新型抑制剂SKI-5C通过LncRNA促进肾母细胞凋亡的机制研究

摘要

目的：肾母细胞瘤是儿童最常见的腹部恶性肿瘤,占小儿恶性实体瘤的8％,虽然近几十年来肾母细胞瘤的预后显著改善,但是除了昂贵的治疗费用,化疗、放疗带来的毒副作用依然显著,亟需寻找一种针对肾母细胞瘤的高效率、低毒性的治疗方法.多项研究已表明SPHK1作为癌基因促进多种肿瘤的发生,然而临床上尚缺乏针对SPHK1的靶向治疗方法.SKI-5C是新近开发的SPHK1的抑制剂，本研究旨在探究SKI-5C对小儿肾母细胞瘤的抗肿瘤活性及其机制。rn 方法：SK-NEP注细胞的增殖用CCK8实验进行评估;采用膜联蛋白V/碘化丙陡染色结合流式细胞分析法检测细胞凋亡;用Westernblot法检测Caspase-3和PARP的切割验证细胞的凋亡发生;采用Arraystar LncRNA Microarray获得SKI-5C处理后的基因表达和LncRNA表达差异谱。rn 结果：本研究发现SKI-5C对肾母细胞株SK-NEP-1具有明显的杀伤作用，细胞半数杀伤浓度(IC50)约为6uM.SKI-5C(l0uM)处理24h后显著诱导SK-NEP-1发生凋亡，与对照组相比，处理组的凋亡比例达49.0%，抗凋亡蛋白Bcl-2mRNA下调720倍，促凋亡蛋白DNAJA3上调166倍。同时，SKI-SC处理组caspase-3和PARP出现切割也表明细胞发生了显著的凋亡。通过Arraystar LncRNA Microarray获得的SKI-SC处理后细胞中LncRNAs的差异表达谱显示共有2624种上调表达的LncRNAs和2322种下调表达的LncRNAs。其中一种反义长链非编码RNA RP11-796E2.4在SKI-5C处理后上调42倍。用siRNA敲除表达后SKI-5C在SK-NEP-1细胞中的促凋亡作用显著降低。经基因组定位分析，该LncRNA位于促凋亡蛋白BTG1基因附近，基于BTG1的mRNA并未显示显著变化推测该LncRNA可能从转录后翻译水平来调节BTG1蛋白的表达，进而促进细胞凋亡。rn 结论：本研究证明SKI-5C具有明显的诱导肾母细胞SK-NEP注凋亡的作用。分子机制研究显示SKI-SC通过诱导特定长链非编码RNA RP11-796E2.4调节促凋亡蛋白BTG1的表达以实现诱导凋亡的作用，该项研究为将有助于阐明SKI-5C的抗肿瘤分子机制，为临床治疗肾母细胞瘤提供新的思路和方法。