1IMI-2碳青霉烯酶的克隆表达、纯化及其活性分析

摘要

目的：构建表达IMI-2碳青霉烯酶的重组质粒,并在E.coli中表达获得基因重组蛋白,纯化重组蛋白并对其活性作初步研究。方法 设计四对引物,采用PCR法获得带有Nde1和Xho1酶切位点的IMI-2碳青霉烯酶基因片段,分别将其转入载体pet-32a,获得重组质粒,经测序鉴定后转化入宿主菌E.coli BL21(DE3)中,以SDS-PAGE分析目的蛋白的表达,采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白,以亚胺培南作为底物对重组蛋白活性进行初步研究。结果 四个重组质粒经酶切鉴定和测序证明都含有IMI-2碳青霉烯酶基因,其中IMI-2CC-Pet32a重组质粒在E.coli BL21(DE3)中较好地表达得到分子量约为32kD目的蛋白,经固相镍离子亲和层析纯化后,重组蛋白纯度达90﹪以上,并具对亚胺培南有较好的水解活性。结论 纯化后的重组蛋白仍具有生物活性,对亚胺培南具有很强的分解能力。IMI-2碳青霉烯酶可以利用大肠杆菌的原核表达系统高效表达并通过纯化达到较高的纯度。