结核杆菌噬菌体D29 LysinB的克隆表达、纯化及活性分析

摘要

结核病是危害人类健康的重大传染病,由于结核杆菌多重耐药菌株的出现,使得结核病的防治形势日益严峻,寻找和研发新型抗结核药物以缩短治疗时间和杀死耐多药与严重耐多药结核杆菌势在必行。这些新药物需具有以下几个特点：(1)高效的抗结核菌活性。(2)对耐多药结核菌株有杀灭作用。(3)不会产生副作用且不会产生耐药性菌株。
　　 噬菌体的发现和噬菌体裂解酶的研究为感染耐药结核杆菌的治疗带来了希望。目前,国内外对结核杆菌噬菌体裂解酶的研究还处于起步阶段。虽然有些噬菌体的裂解酶基因组序列已被破译,但它们的裂解酶基因尚未发现。噬菌体D29是一种烈性噬菌体,能裂解结核分支杆菌和耻垢分支杆菌。氨基酸序列分析表明D29的LysB(gp12)与Ms6的LysB同源性为43％。噬菌体D29的LysB不仅具有分解脂肪的活性,还是一种新型的分支菌酸酰基阿拉伯半乳糖酯酶,它能裂解分支菌酸酰基阿拉伯半乳糖连接键并释放出游离的分支菌酸,对于辅助内溶素实现对分支杆菌的裂解以及提高宿主菌的裂解效率方面发挥着重要的作用。鉴于此,我们克隆表达了噬菌体D29 LysB蛋白,对蛋白的表达条件进行优化,测定表达蛋白的脂肪酶活性,研究酶活的最佳温度、最佳pH以及热稳定性和pH稳定性,初步分析了其酶学性质。本课题研究的主要内容及结果如下:
　　 1.构建克隆及表达载体实现目的蛋白的表达:首先以噬菌体D29基因组为模板,采用PCR方法扩增lysB基因,构建pMD-lysB克隆载体转化进入E.coli DH5a完成lvsB基因的克隆。克隆后的lysB基因双酶切后与载体pET22b连接,得到表达载体pET22b—lysB。将重组质粒转化进入E coli BL21(DE3)中,IPTG诱导即可实现目的蛋白的表达。
　　 2.优化蛋白表达条件及重组蛋白的纯化:蛋白可溶性分析表明,部分重组蛋白是可溶性的。通过对IPTG浓度和诱导时间的优化,确定出表达最佳条件为:25℃,IPTG终浓度为0.05mM条件下诱导10h。在此条件下,SDS—PAGE薄层扫描分析显示重组蛋白(His—LysB)约占全菌总蛋白的50％以上,重组蛋白(His—LysB)大部分是可溶性的,占全菌可溶性总蛋白的48.1％。采用镍柱亲和层析(Ni—NTA)纯化了可溶性表达产物,纯化后的重组蛋白纯度大于85％,经浓缩透析后测定蛋白浓度为3.7 g／L,从1 L的LB培养物中可获得33.2 mg高纯度His—LysB。
　　 3.重组蛋白酶学性质研究:经Ni-NTA纯化后的重组蛋白在分别含有Tween80和Tween20的LB平板上呈现出分解脂肪的活性,说明该蛋白属于脂肪酶。以pNPB为底物,研究了重组蛋白的酶学性质,结果表明该酶的热稳定性较差,在30℃以下比较稳定,温度高于30℃时,酶活力下降较快；重组蛋白具有较广的pH范围,在pH5～9.5之间较稳定。在23℃和pH7.5处呈现出最佳的活性,比活性为1.3 U／mg。在所测试金属离子和抑制剂中,金属离子Zn2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+和PMSF抑制剂对酶活具有强烈的抑制作用,所以该酶在处理和保存的过程中尽量避免与这些影响因子的接触。
　　 综上所述,本研究成功构建了克隆载体pMD-lysB和表达载体pET22b-lysB,重组质粒pET22b—lysB转化E.coli BL21(DE3)后获得了较高产量的重组蛋白His—LysB。获得的His—LysB呈现出较高的脂肪酶活性,具有较宽泛的pH范围,但热稳定差且对多种金属离子和抑制剂敏感。本试验的研究结果不仅为今后研究分支杆菌噬菌体裂解酶基因簇之间及其与宿主菌之间的相互作用机制奠定了基础,而且对于将裂解酶应用于结核病治疗方面具有重要的意义,为开发新的治疗结核药物提供了一个新的选择。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1.1 结核病流行及治疗现状

1.2 噬菌体在抗菌治疗方面的研究

1.3 噬菌体裂解酶在抗菌治疗方面的研究

1.4 分支杆菌噬菌体裂解酶的研究

1.5 本课题研究的目的和主要内容

1.6 本课题研究的创新点

第二章 噬菌体D29 LysinB的克隆

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 噬菌体D29 Lysin B的表达、可溶性分析及纯化

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 噬菌体D29 Lysin B的活性鉴定与酶学性质分析

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第五章 全文总结

参考文献

在校期间的研究成果及发表的学术论文

致谢

附录