日本血吸虫精氨酸酶的克隆表达及酶活性分析

摘要

本课题组在前期日本血吸虫体被表膜蛋白研究中鉴定到精氨酸酶,为进一步阐明日本血吸虫精氨酸酶(SjARG)的特性和生物学功能,应用PCR克隆了SjARG基因,构建了重组表达质粒pET-28a-SjARG,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达并纯化到可溶性重组蛋白rSjARG,分子量约为43kDa.Western-blotting分析显示重组蛋白具有良好的抗原性.实时定量PCR分析显示SjARG在尾蚴时期高表达,基因转录拷贝数约为其它时期的20-100倍,在42d成虫中雌虫的基因转录水平显著高于雄虫.免疫组化实验结果表明SjARG在各期虫体的表膜、实质部分均有分布,在42d成虫雌雄虫生殖器官部位表达较集中.利用纯化的rSjARG重组蛋白建立了体外酶活性分析体系,酶活性分析结果表明重组蛋白rSjARG酶活性为502.67 U/mg,最适pH为10.2,最适温度为37℃,Km值为0.0827 mol/L.Mn2+能显著提高rSjARG的活性.精氨酸酶特异性抑制剂nor-NOHA和NOHA对SjARG均有抑制作用,但两者的抑制效果和底物精氨酸的浓度有关.