棉铃虫酯酶突变体的构建、表达及酶促动力学特性分析

摘要

在前期研究的基础上,基于定点突变技术在棉铃虫酯酶001F和001G的A127位和F238位分别人工构建由丙氨酸(A)变为天冬氨酸(D)、苯丙氨酸(F)变为亮氨酸(L)的单、双位点突变体,利用杆状病毒载体表达系统对其进行异源真核表达,采用酶标仪测定表达产物对α-乙酸萘酯和4-硝基苯基乙酸酯的酶促动力学参数.rn 结果表明:酯酶A127位突变降低了酯酶的酶促水解活性,其对底物的亲和力明显减弱(反应常数Km值变大),速率常数kcat/Km值仅为突变前的1/20～1/90; F238位突变对酯酶的酶促水解作用影响相对较小,其kcat/Km值为突变前的1/2～1/7;双位点突变体(A127D/F238L)几乎全部失去了对底物的酶促水解活性,其亲和力明显下降(Km值升高至突变前的4-30倍),kcat/Km值为0.09～0.33μmol-l·s-1·L,仅为突变前的1/70～1/370.表明突变对酯酶活性有明显影响,A127位和F238位氨基酸残基是与酶催化功能相关的重要位点,这将为研究酯酶在棉铃虫代谢抗性中的作用提供一定的参考.