产气荚膜梭菌ε毒素基因的克隆、表达及其特异性血清的制备

摘要

从B型产气荚膜梭菌C58-2中扩增出了ε毒素完整成熟肽基因的片段，克隆到pGEM-T Easy载体后，选取阳性重组子，经PCR和双酶切鉴定后，提取质粒并双酶切，最终克隆到pET28a载体中，并转化到BL21(DE3)受体菌中，经PCR、双酶切和测序鉴定，表明目的片段已成功的克隆到pET28a中；用IPTG对重组菌进行了诱导表达，SDS-PAGE结果表明，诱导后的菌体蛋白中多了一条蛋白带，且与预期的ε毒素蛋白的分子量大小相同，经Western-blotting检测，该蛋白可以与D型产气荚膜梭菌的定型血清发生反应，表明ε毒素基因在大肠杆菌中获得了表达；分别对重组菌在不同时间、IPTG浓度和温度的条件下进行诱导表达，确定了最佳表达条件；对重组菌的表达形式和表达量进行了确定，结果表明，重组蛋白主要位于周质间以可溶性的方式表达，表达量占菌体总蛋白的26.3％，仅有少量以包涵体的形式表达；对表达蛋白进行了毒性试验，结果表明，每毫升培养物提取的蛋白含有100个小鼠MLD，重组蛋白经胰酶活化后，毒力增强了150倍，其毒力与D型产气荚膜梭菌强毒株的毒力相近。重组蛋白经0.4％的甲醛灭活后制成类毒素，免疫家兔制备了针对ε毒素的特异性血清；经毒素-抗毒素中和试验测定，其效价为每ml血清可以中和30000个小鼠MLD的D型产气荚膜梭菌毒素；毒素抗毒素中和试验和琼脂扩散试验证实，所制备的血清是特异性的针对产气荚膜梭菌ε毒素的。