黄花苜蓿MfELIP和MfCAB的克隆、表达特性分析与功能研究

摘要

本实验室采用抑制性消减技术(SSH)构建了黄花苜蓿(Medicagofalcata L.)响应低温的消减文库，从中筛选出早期光诱导蛋白(Early light-induced protein，ELIP)基因受冷诱导，而捕光叶绿素a/b结合蛋白(ChlorophyllA-B binding protem，CAB)受冷抑制. ELIP在强光伤害早期被诱导表达，并与游离的叶绿素、类胡萝卜素结合形成抑制三聚体，有效地阻止游离氧对光合结构的进一步损害；CAB可与色素形成的色素蛋白复合体，捕获光能并把能量迅速传至反应中心引起光化学反应的色素蛋白复合体，在类囊体膜中除了进行光能的吸收和传递之外，在维持类囊体膜的结构，调节激发能在光系统Ⅰ和光系统Ⅱ之间的分配，光保护以及对各种环境的适应等过程中都起着重要的作用。本研究主要是应用分子生物学技术从低温处理的黄花苜蓿叶片cDNA中克隆elip与cab：对获得的基因序列进行生物信息学分析，利用半定量RI-PCR技术，研究这2个基因在低温(5℃)、高温(35℃)、盐(0.5M NaCl)、ABA(100M)以及脱水处理的黄花苜蓿叶片中的表达特征。利用NCBI数据库中同源基因序列设计PCR引物，通过RT-PCR扩增获得了黄花苜蓿MfELIP和MfCAB基因。MfELIP(GenBank登记号：EF422369)全长712bp，开放阅读框600bp，编码199个氨基酸的蛋白；MfUAB基因(GenBank登记号：EU184090)全长846bp，开放阅读框696bp，编码231个氨基酸的蛋白。通过对蛋白氨基酸序列比对(BL,ASTP)发现，MfEUP与紫花花苜蓿ELIP基因同源性较高，达到98％：MfCAB与豌豆(Pisum Sativum L.)CAB基因同源性较高，达到96％。半定量RT-PCR结果表明黄花苜蓿叶片中.MfELIP在低温胁迫下表达量会迅速上调，而对其它胁迫(高温、盐、脱水)及ABA处理不敏感，表明该基因受低温特异诱导，可能与黄花苜蓿的耐寒性密切相关。MfCAB在正常条件下的表达具有明显的内生节奏性，从早上8点到12点，其表达在呈递增趋势，午后开始该基因表达量逐步下降，到晚上其表达量已低于检测水平。MfCAB在低温和高温胁迫下1天内表达量无明显变化，但第2天起迅速下调，直至低于检测水平。MfCAB对盐和脱水胁迫以及ABA处理不敏感。进一步构建了MfELIP和MfCAB基因的超表达载体pBI-ELIP和pBl-CAB，准备转化模式植物烟草(Nicotianatabacum L.)和截形苜蓿(Medicago truncatula L.)，以进行基因功能分析，同时还将构建原核表达载体和酵母表达载体，以便更好的研究基因编码蛋白产物的性质与功能。