CD2相关蛋白启动子调节区域的功能特征

摘要

目的CD2相关蛋白(CD2AP)在肾小球硬化、肾病综合症的发病中起重要作用，在几种肾小球疾病中其RNA表达有改变，在基因转录调控方面启动子对表达量起十分关键的调节作用，启动子有组织特异性，目前尚未见该分子的启动子在HEK 293细胞中详细分析的报道。本研究的目的是在该细胞中分析CD2AP的启动子及其重要的转录调控序列。方法用5’快速cDNA末端扩增法，寻找转录起始位点；构建系列缺失突变和点突变的质粒，测定它们的荧光素酶功能活性，确定核心启动子及重要调控元件的范围和类型；生物信息学转录因子结合位点软件分析推断的转录因子结合位点；生物信息学物种间比较，证实和发现新的重要保守调控元件，过表达Spl和Sp3转录因子观测其对CD2AP的调控作用。结果CD2相关蛋白在HEK 293细胞有多个转录起始位点，集中于两个区域。离翻译起始位点上游约500 bp内的区域有弱的基本的核心启动子活性，再往上游100 bp至3 kb的缺失构建体的荧光素酶功能活性增加5倍，结合该强启动子区域位于另一个转录起始区域，表明这是另一个功能强大的核心启动子。两个启动子都缺乏TATA。有两个紧邻的Spl／Sp3位点位于上游的那一个强启动子内，如果两个位点同时缺失，则上游的那一个启动子的活性恢复为下游那个基本启动子的活性，缺失第一个Spl／Sp3位点使强的启动子活性减少到原有活性的1/3。两个位点同时点突变使活性下降50％。Spl转录因子蛋白过表达可使启动子活性增加6倍，而过表达Sp3使该启动子活性降低50％。用SNP数据库分析的方法，发现CD2AP启动子区有9个单个核苷酸多态性位点，但它们均不在转录起始位点或推断的转录因子结合位点区域。甲膑综合征有。肾脏病变，与之有关的Lmx1b转录因子在小鼠中可调节CD2AP，我们发现了3个Lmx1b结合位点，使它们缺失并未改变启动子活性，这与报道的在甲膑综合征病人中CD2AP表达正常一致。物种间比较发现牛、猪的CD2相关蛋白转录起始位点、Spl／Sp3结合位点与人的相应启动子区域高度保守，但小鼠与人的启动子区域同源性较差。在HEK 293细胞中未发现全反式维甲酸对CD2相关蛋白启动子活性的增强作用，相反全反式维甲酸使CD2AP表达下降，提示在动物中报道的该药物的有益治疗作用在用于病人时需谨慎，这与其他报道相一致。讨论CD2AP在HEK 293细胞中有两个启动子区域及多个转录起始位点，Spl／Sp3位点缺失和点突变分析发现Spl和Sp3是调控CD2相关蛋白基因表达的重要转录因子，这些结果为未来的变异研究和潜在的新药研究提供了基础。有报道转录起始位点的点突变可导致基因表达下降而致病，有多个Spl／Sp3位点缺失或点突变而致病的报道，至今，仅见2例在CD2AP编码区发现突变而导致局灶节段性肾小球硬化的病例报道，由于CD2AP表达下降也见于普通的肾病综合征和IgA肾病，本研究结果提示位于该基因编码区上游的启动子区也需筛查突变或作多态性分析，尤其是在Spl／Sp3结合位点。有报道全反式维甲酸可加强Spl与启动子的结合，丁酸钠可加强依赖Spl的启动子的乙酰化，这样，即使Spl位点点突变使转录下降的原发因素未消除，丁酸钠仍取得了使有关疾病显著改善的临床疗效，由于本研究发现CD2AP是受Spl调控的基因，这为难治性肾病综合征的治疗提供了新的探索方向。