人CD2相关蛋白剪接异构体启动子区的克隆及microRNA-548k对其调控机制的研究

摘要

目的:克隆人CD2相关蛋白剪接异构体(CD2AP002)启动子区，探讨microRNA-548k(miR-548k)能否通过靶向结合该剪接异构体启动子序列参与其转录调控。
　　方法:采用PCR方法获取CD2AP002基因5'侧翼序列及一系列5'端缺失体，定向插入到pGL3-Basic载体中，双萤光素酶报告基因检测系统鉴定其启动子活性;RegRNA2.0在线软件预测CD2AP002启动子区域潜在的miR-548k的结合位点;荧光原位杂交实验(FISH)检测miR-548k在HEK293细胞内的定位，细胞免疫荧光实验(IF)观察RNA干扰蛋白(AGO2)在HEK293细胞内的分布;利用点突变/缺失突变技术、miR-548k模拟剂(miR-548k mimic)/miR-548k抑制剂(miR-548k inhibitor)的转染、实时定量PCR(Real time quantitative PCR)技术，鉴定miR-548k是否能通过靶向CD2AP002启动子的潜在结合位点调控CD2AP002的转录;转染miR-548k模拟剂(miR-548k mimic)后，染色质免疫沉淀(ChIP)检测RNA聚合酶Ⅱ在人CD2AP002启动子区域的富集情况。
　　结果:成功构建有活性的人CD2AP002质粒;通过生物信息学预测，在CD2AP002启动子区域含有两个miR-548k靶向结合位点;FISH证实miR-548k可见于HEK293细胞核、IF证实AGO2蛋白在HEK293细胞的胞核里有分布;miR-548k通过结合CD2AP002启动子上两个结合位点可在启动子和mRNA水平上正向调控CD2AP002; ChIP实验发现RNA聚合酶Ⅱ在CD2AP002启动子区的富集。
　　结论:成功构建出有活性的人CD2AP002质粒;miR-548k通过靶向结合CD2AP002启动子上调CD2AP002的表达，该过程中有RNA聚合酶Ⅱ的富集。

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声明

常用缩略词中英文对照

摘要

前言

第一部分 人CD2AP的剪接异构体CD2AP002启动子区的克隆

引言

材料和方法

结果

讨论

第二部分 miR-548k对人CD2AP002启动子调控机制的研究

引言

材料和方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

综述 微小RNA与基因表达调控

攻读硕士学位期间公开发表的学术论文

致谢