有机阴离子转运蛋白1(OAT1)在马兜铃酸Ⅰ肾细胞转运及其细胞毒性中的作用

摘要

目的：探讨有机阴离子转运蛋白1(OAT1)在马兜铃酸I(AAI)肾细胞转运中的作用及其毒效关系。rn 方法：体外构建重组大鼠OAT1(rOAT1)基因的真核表达质粒，将rOAT1重组质粒导入人胚肾细胞(HRK 293)。观察rOAT1及其特异性底物对氨基马尿酸(PAH)阻断后对AAI摄取的作用，并分别观察不同浓度AAI对转染细胞caspase 3 mRNA和细胞凋亡的影响。Western blot检测转染细胞rOAT1表达；毛细管电泳法检测细胞内PAH浓度；高效液相色谱法(HPLC)检测细胞内从浓度。RT-PCR检测细胞caspase 3 mRNA表达，流式细胞法(Annexin V-FITC)检测细胞凋亡水平。rn 结果：转染含rOATl质粒的HEK-293细胞特异性表达rOAT1。以40μg/ml、80μg/ml、120 μg/ml和160 μg/mlAAI分别刺激细胞45min，转染rOAT1组细胞内从I浓度是空载体组的2～6倍，两组细胞内AAI浓度分别为13.6±3.2 vs 4.84±2.9：20.0±5.6 vs 8.44±3.8；27.6±3.1 VS11.8±1.3和54.5±19.1vs 15.7±2.4，pg/mg.protein(p均<0.05)。以120 μg/mlAAI分别刺激细胞30min、60min、90min和120min，转染组与空载体组细胞内从I浓度分别为3.6±2.1 vs5.1±0.8；22.1±7.2 VS 9.1±3.4；30.3±5.5 vs 13.6±3.9和48.O±3.5 vs 18.0±6.0，pg/mg.protein(p均<0.05)。加入PAH(5mM)特异性阻断OAT1 35min后，以上述不同浓度AAI分别刺激转染细胞，细胞内AAI浓度显著低于未阻断组，分别为3.1±0.8：80 vs7.7±2.4；3.7±0.8 vs 13.5±3.0；6.34-3.0vs；21.5±8.2；7.54-3.5，vs 41.7±6.3 pg/mgproein.(p均<0.05)。以上述不同浓度AAI分别刺激转染细胞和空载体细胞，两组细胞easpase 3mRNA表达及细胞凋亡随AAI浓度上升而增加，两组细胞凋亡率分别为33.7%VS 15.85%；47.6%VS18.6%；56.9%VS 22.3%：68.6%VS 31.0%(p均<0.05)。rn 结论：转染含rOAT1质粒的HEK-293细胞特异性表达rOAT1。AAI呈浓度依赖性和时间依赖性进入rOAT1转染细胞，并呈剂量依赖性诱导OAT1表达细胞凋亡。提示OATl特异性介导AAI肾细胞转运及细胞毒性。