骨骼肌损伤后修复过程印记基因H19和Grb10表达的研究

摘要

研究目的：rn 印记基因是指仅一方亲本来源的同源基因表达,而来自另一亲本的不表达.印记基因的异常表达引发伴有复杂突变和表型缺陷的多种人类疾病.研究发现许多印记基因对胚胎和胎儿出生后的生长发育有重要的调节作用,对行为和大脑的功能也有很大的影响,印记基因的异常同样可诱发癌症.H19基因编码一个2.3kb的非编码RNA分子,其母系等位基因表达,父系印迹,在哺乳动物中呈现进化上的保守性,是最早被鉴定的印迹基因之一.H19印记基因在胚胎发育过程中高丰度表达,主要集中表达于内胚层及中胚层来源的组织.然而出生后H19的表达降低,仅在心肌及骨骼肌中有一定的表达,而人体骨骼肌是由中胚层发育而来.本研究旨在通过检测骨骼肌损伤后修复过程中是否存在H19表达,为骨骼肌损伤后修复再生的基因治疗提供新的思路.rn 研究方法：rn 湖北省实验动物研究中心购买健康成年雄Sprague-Dawley大鼠，体重260～300g，适应性饲养一周进行骨骼肌钝伤造模。采用戊巴比妥钠麻醉大鼠，50mg/kg体重标准进行腹腔注射。麻醉后首先将大鼠仰卧位，后肢置于伸膝的位置，然后使大鼠踝背屈90°，用记号笔对右后肢腓肠肌中段处进行染色标记，将自制打击器对准标记位置处，以保证打击重物尽可能准确将力施与腓肠肌中段。打击重物370g，高度66cm，落至自制打击器（自制打击器打击面积约0.75㎝2）。打击位置为大鼠右后肢腓肠肌中段内侧面（打击处中心点距跟骨距离约1.15cm，打击动能为2.39J）。打击后受伤局部皮肤完好，将大鼠放置鼠笼中观察其爬行，大鼠出现明显的跛行。损伤造模成功后，每只单独饲养，并给予饲料及自来水，保持挚料清洁及空气通畅。损伤后3d、6d将大鼠脱颈法处死，将大鼠跟骨位置处外翻固定，取右后肢损伤部位腓肠肌，并取左后肢相同部位腓肠肌做为对照。采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法检H19及Grb10印记基因的表达。液氮条件下提取总RNA，随后进行常规逆转录、PCR扩增、50mV电压下电泳35min。观察凝胶成像系统中凝胶，调整并采集图像。利用GeneTool分析采集到的图像，记录各条带的亮度值，并计算出其相对表达量（以β-actin为内参），检测H19，Grb10的表达。rn 研究结果：rn 健康成年雄Sprague-Dawley大鼠健侧腓肠肌中段，H19和Grb10印记基因均有一定量的表达。在损伤侧，损伤后3d，H19印记基因表达量未出现明显变化，6d表达量明显升高；损伤后3d，Grb10印记基因表达量较低，6d表达量逐渐升高。rn 研究结论：rn 骨骼肌钝伤激活H19和Grb10印记基因的表达，H19和Grb10印记基因可能通过某种机制参与骨骼肌损伤后的修复，该机制尚不明确，有待进一步的研究。