过表达LMP-1和HIF-1a双基因的脂肪源性干细胞高效成骨分化的研究

摘要

体育运动中高能量创伤常造成开放性骨折并软组织损伤,另一方面运动员的应力性骨折,因训练及赛事的紧密,均可导致骨延迟愈合或骨不连的发生.基因治疗的提出和发展为运动员骨折的临床修复开拓了新的研究领域.前期已证实LIM矿化蛋白-1(LMP-1)可调控干细胞向成骨细胞分化.第3代ADSCs表面标志物CD29和CD49d呈强阳性表达，而CD45及CD31呈阴性表达，表明ADSCs获取成功。而构建的慢病毒载体pLVX-EF1α-DsRed-Hyg-rLMP-1、pLVX-EF1α-AcGFP-rHIF-1α经菌落PCR鉴定及载体测序证实表达序列和表达框均正确。MTT结果显示转染后各组细胞生长未受影响，且HIF-1a组及双基因组细胞生长最快（P＜0.01）。RT-PCR结果显示，目的基因转染ADSCs后双基因组细胞中LMP-1和HIF-1α的mRNA高效共表达，至21d仍维持在较高水平，且其表达水平与单转组无明显差异，提示rLMP-1和rHIF-1α可有效地转染入大鼠ADSCs。而RT-PCR检测各组不同时间点成骨基因的表达结果显示，LMP-1组及双基因组各成骨因子表达水平均显著增高（P＜0.01），而双基因组ADSCs中各成骨因子的表达水平也明显高于LMP-1组（P＜0.05）。但HIF-1α组与空载体组相比无明显差异，仅VEGF的表达水平明显高于空载体组（P＜0.01）。然而，双基因组除成骨因子明显高于其他组别之外，VEGF的表达水平在转染后也明显高于空载体组（P＜0.01），但与HIF-1α基因组相比较无明显差异。转染14天后，双基因组无论是ALP酶活性，还是钙结节数量均明显高于单独的LMP-1基因组或HIF-1α基因组。慢病毒载体介导的LMP-1及HIF-1α双基因转染ADSCs较各单基因组可明显地提高ADSCs成骨分化能力，此结果为今后应用于运动骨折修复提供了坚实的理论基础。