中药复方冠心Ⅱ号心脏保护的抗凋亡及抗炎机理研究

摘要

目的：冠心Ⅱ号(GⅫ)是治疗冠心病的有效中药复方，其药物组成为丹参、川芎、红花、赤芍、降香按照2：1：1：1：1比例构成。丹川红(DCH)煎剂是GXⅡ子方，其药物组成为丹参、川芎、红花按照2：1：1比例构成。本研究探索：(1)长期小剂量GXⅡ经由Akt信号通路抑制心肌凋亡的心脏保护机理;(2)GXⅡ急性灌胃经由NF-κB诱导抗炎的心脏保护机理;(3)DCH煎剂经由Akt／NF-κB通路诱导的抗炎作用是否与吸收生物活性成分FAT(阿魏酸、羟基红花黄色素A、丹参素)相关。rn 方法：(1)SD大鼠被随机分为四组：假手术组、对照组、口服GⅫ剂量组(2.5 g／kg／d和0.5 g／kg／d).大鼠灌胃GⅫ或等容积0.9％NaCl qd×15d。大鼠急性心肌梗塞(acute myocardialinfarction,AMI)造模前30 min最后一次灌胃GⅫ或0.9％NaCl，除了假手术组，其余大鼠均结扎冠状动脉。AMI 24-h后采集大鼠心脏，应用组织化学染色法测定24-h心肌梗塞面积(IZ)。大鼠AMI 3-h后采集心脏，应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记法(TUNEL)检测大鼠心肌缺血区心肌细胞凋亡指数;免疫组化法检测心肌细胞凋亡调控基因Bcl-2，Bax比值;免疫印迹法测定心肌细胞胞浆总Akt(total Akt)与磷酸化Akt(p-Akt)活性，心肌细胞胞浆和线粒体中的细胞色素C(cytochrome C)释放;比色法测定心肌细胞caspase-3，caspase-9活性。(2)SD大鼠被随机分为四组：假手术组、对照组、口服GⅫ剂量组(15 g/kg，5g/kg)。大鼠AMI造模前30 min一次性灌胃GⅫrn 或等容积0.9％NaCl。除了假手术组，其余大鼠均结扎冠状动脉.AMI 24-h后采集大鼠心脏，测定IZ。大鼠AMI 3-h后，采集心脏及血清，应用免疫印迹法测定心肌细胞胞浆与胞核的核因子(Nuclearfactor-kappa B，NF-κB)表达，酶联免疫法(EUSA)测定C反应蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)血清水平。(3)SD大鼠被随机分为四组：假手术组、对照组、DCH煎剂(13.33 g/kg)组、FAT组(阿魏酸F 3.14 mg／kg;羟基红花黄色素A 48.76mg／kg和丹参素T 17.08 mg／kg)。大鼠AMI造模前30 min一次性灌胃DCH煎剂或FAT。除了假手术组，其余大鼠均结扎冠状动脉。AMI 24-h后采集大鼠心脏，测定IZ。大鼠AMI 3-h后，采集心脏及血清，用ELISA法测定CRP血清水平;免疫印迹法测定心肌细胞胞浆与胞核的NF-κB表达，心肌细胞胞浆total Akt与p-Akt活性。rn 结果：(1)与对照组相比，长期小剂量口服GⅫ(2.5g/kg)降低IZ、降低心肌细胞凋亡指数、增加p-Akt活性、升高Bcl-2／Bax比值、抑制cytochrome C释放、抑制caspase-3，caspase-9活性。GⅫ(0.5g／kg)在上述指标则无治疗效果。(2)与对照组相比，GXII(15g／kg)能降低IZ、降低NF-κB表达、降低血清TNF-α,IL-6，CRP水平。GⅫ(5g／kg)在上述指标则无治疗效果。(3)与对照组相比，DCH煎剂及FAT都能降低IZ、增加p-Akt活性、降低NF-κB表达、降低血清CRP水平。rn 结论：(1)长期小剂量预先灌胃GⅫ降低IZ，通过激活心肌细胞Akt酶活性，进一步经由调节Bcl-2家族蛋白表达，cytochrome C介导的Caspases通路，从而起到抗心肌细胞凋亡作用。(2)一次性灌胃GⅫ降低IZ，经由抑制NF-κB蛋白表达，降低前炎性细胞因子IL-6，TNF-α水平，进一步降低炎症指标血清CRP水平，从而起到抗炎样心脏保护作用。(3)DCH煎剂及其成分FAT都可降低IZ，经由Akt／NF-κB通路降低血清CRP水平，达到抗炎性心脏保护作用。DCH煎剂抗炎作用的效应成分是FAT.上述研究表明：GⅫ对心肌梗塞大鼠的心脏保护作用可能经由Akt信号通路，通过抑制凋亡与炎症机制来发挥;Akt信号通路是GⅫ心脏保护作用的上游靶点;FAT是GⅫ抗凋亡、抗炎作用的吸收生物活性成分。