西藏小型猪OBR基因克隆及ECD近跨膜区重组融合蛋白制备

摘要

目的：克隆西藏小型猪OBR基因并原核表达ECD近跨膜区重组融合蛋白。方法：（1）根据猪OBR基因序列(GenBank号：AF092422.1)设计并合成5条特异性引物，以西藏小型猪肝脏组织总RNA为模板，经RT-PCR方法获得了OBR基因ECD（胞外域）和 ICD（胞内域）片段；再以这两片段为模板，利用Overlap PCR法扩增OBR基因全cDNA序列，序列测定后与GenBank上报导的其它动物作同源性比较及亲缘进化树分析。（2）另设计1对带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点特异性引物，扩增OBR基因ECD近跨膜区（1705-2364bp），经酶切后连接到表达载体pRSETA的BamHⅠ和HindⅢ两酶切位点之间，构建重组表达质粒并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达，SDS-PAGE电泳分析和western blotting鉴定表达产物。结果：（1）同源性比较及亲缘进化树分析显示，与广西巴马小型猪、家猪的亲缘性最高（99.6％），其次奶牛（91.1％），再次犬（90.0％），人类为88.3％；（2） SDS-PAGE电泳分析和western blotting鉴定结果显示，在IPTG诱导下OBR基因克隆及ECD近跨膜区重组表达菌表达了相对分子质量约27.6KDa左右的融合蛋白。结论：成功表达西藏小型猪ECD近跨膜区融合蛋白，为下一步研究OBR基因的功能、研究肥胖发病机制、探寻预防与控制肥胖方法奠定基础。