激活Wnt/β-catenin信号通路在提高水牛体外胚胎生产效率中的应用

摘要

本发明涉及水牛体外胚胎生产技术领域，特别涉及激活Wnt/β‑catenin信号通路在提高水牛体外胚胎生产效率中的应用，本发明针对水牛的Wnt/β‑catenin信号通路进行研究，最终发现，Wnt通路的抑制剂会降低水牛卵母细胞的成熟率，而Wnt通路的激活剂能提高水牛卵母细胞的成熟率。为此，申请人通过在水牛卵母细胞成熟液中添加Wnt通路激活剂氯化锂(LiCl)来实现提高水牛卵母细胞的成熟率、水牛胚胎分裂率和水牛胚胎囊胚率的目的，从而对水牛体外胚胎生产效率起到了良好的促进作用。

说明书

【技术领域】

本发明涉及水牛体外胚胎生产技术领域，特别涉及激活Wnt/β-catenin信号通路在提高水牛体外胚胎生产效率中的应用。

【背景技术】

繁殖效率低下是目前水牛产业化发展的瓶颈，而利用体外胚胎生产这类繁殖新技术可以一定程度上提高水牛良种胚胎供应能力，本领域技术人员的长期研究发现，不同物种之间的体外胚胎发育能力不同，同为牛属，但水牛卵母细胞的体外发育潜能仍远低于黄牛。经研究，水牛卵母细胞的体外成熟率约为50-65％，而黄牛卵母细胞的体外成熟率约为80-90％；水牛卵母细胞的体外囊胚率约为18-25％，而黄牛卵母细胞的体外囊胚率约为30-45％。正是由于水牛的体外胚胎生产效率低，限制了水牛体外繁殖在水牛产业化的推广应用。

申请人一直致力于提高水牛胚胎的体外发育能力，现有技术中报道Wnt/β-catenin信号家族成员是卵巢功能调控的重要因素，Wnt通路影响雌激素的生成并调控卵泡刺激素(FSH)的作用，然而对小鼠的研究却表明其卵母细胞的成熟并不依赖Wnt通路，在鼠体内过表达β-catenin还会阻断卵母细胞的减数分裂成熟；而在某些猪物种中，研究发现WNT/β-catenin特异性抑制剂FH535可以促进猪卵母细胞的成熟；而在申请人的后期研究中发现，在水牛物种中并不存在上述效果。因此，由于Wnt通路连锁基因的相对复杂，WNT/β-catenin通路在不同物种之间的差异巨大。为此，有必要针对Wnt通路对水牛卵母细胞发育潜能的影响进行研究，找出一种适合水牛物种体外胚胎发育的方法，提高水牛的体外繁殖率。

【发明内容】

鉴于上述内容，有必要针对Wnt通路对水牛卵母细胞发育潜能的影响进行研究，找出一种适合水牛物种体外胚胎发育的方法，提高水牛的体外繁殖效率。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

激活Wnt/β-catenin信号通路在提高水牛体外胚胎生产效率中的应用，在体外环境下，通过添加Wnt/β-catenin信号通路的激活剂来激活Wnt/β-catenin信号通路从而促进水牛卵母细胞的成熟和之后的胚胎发育效率。

进一步的，所述激活Wnt/β-catenin信号通路的激活剂为氯化锂。

本发明还包括一种提高水牛外胚胎的生产效率的方法，所述方法为：

(1)获取水牛卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte-complexes，COCs)；

(2)将步骤(1)获取的复合体放入成熟培养液中进行体外成熟培养；所述成熟培养液中应用了所述激活Wnt/β-catenin信号通路的激活剂；

(3)成熟培养24h后取水牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)转入覆盖石蜡油的IVM液微滴内，培养22-24h；

(4)将步骤(3)成熟的水牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)转入体外受精(IVF)液微滴中，与水牛精子共同孵育22-24h，完成体外受精；

(5)将步骤(4)受精后的水牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)用胚胎培养液清洗3次后，用卵丘细胞单层液替代胚胎培养液对清洗后的受精卵进行胚胎培养，即得水牛的体外胚胎。

进一步的，所述步骤(2)的成熟培养液其组分由如下成分组成：体积百分比为10％的胎牛血清(FBS)、5ng/mL的卵泡刺激素(FSH)、10ng/mL的黄体生成素(LH)、0.2mM的丙酮酸钠、1μg/mL的雌二醇(E2)、50μM半胱氨酸、25ng/mL的表皮生长因子(EGF)、10μM的氯化锂(LiCl)；余量为TCMl99培养液。

进一步的，所述步骤(5)的卵丘细胞单层制备方法为：将屠宰场获得的水牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)成熟培养24h后，取2-3个卵丘细胞扩展良好的水牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，转入覆盖石蜡油的40μL胚胎培养液微滴内，用100μL枪头吹打使卵丘细胞均匀分布于微滴内，培养2-4天，使卵丘细胞在微滴内生长到100％汇集，得到胚胎培养用的卵丘细胞单层。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明针对水牛的Wnt/β-catenin信号通路进行研究，最终发现，Wnt通路的抑制剂会降低水牛卵母细胞的成熟率，而Wnt通路的激活剂能提高水牛卵母细胞的成熟率，且上述差异达到极显著水平，为此，申请人针对该原理，通过在水牛卵母细胞成熟液中添加Wnt通路激活剂氯化锂(LiCl)来实现提高水牛卵母细胞成熟率的效果，从而达到提高水牛的体外胚胎生产效率的目的。经过检测，成熟液中添加Wnt通路激活剂氯化锂(LiCl)后，水牛卵母细胞的成熟率达到90.01±9.33％；水牛胚胎分裂率达到65.22±7.45％；水牛胚胎囊胚率达到47.38±3.75％；均显著高于未添加激活剂的对照组，对水牛体外胚胎生产效率起到了良好的促进作用。

【附图说明】

图1为Wnt经典通路抑制剂(IWR-1)对基础的和FSH诱发的颗粒细胞E2生成和增殖的影响图；其中，A为：Wnt经典通路抑制剂(IWR-1)对基础和FSH诱发的颗粒细胞E2生成能力的影响；B为：Wnt经典通路抑制剂(IWR-1)对基础和FSH诱发的颗粒细胞增殖能力的影响。

图2为Wnt经典通路抑制剂(IWR-1)对FSH靶基因mRNA表达的影响图；其中，A为：1μM的Wnt通路抑制剂(IWR-1)对CYP19A1在mRNA表达水平的影响；B为：1μM的Wnt通路抑制剂(IWR-1)对CCND2在mRNA表达水平的影响；C为：1μM的Wnt通路抑制剂(IWR-1)对CARTPT在mRNA表达水平的影响。

图3为Wnt经典通路抑制剂对Wnt通路活性的影响图；其中，A为：Wnt通路抑制剂(IWR-1)对Wnt通路成员AXIN2蛋白表达量的影响；B为：Wnt通路抑制剂(IWR-1)对Wnt通路成员CTNNB1蛋白表达量的影响；C为：不同条件下IWR-1处理后AXIN2和CTNNB1蛋白及看家蛋白ACTIN的蛋白免疫印迹图。

图4为Wnt经典通路抑制剂(IWR-1)对水牛卵母细胞成熟效果的影响图；

图5为Wnt经典通路抑制剂(IWR-1)对水牛卵母细胞内Wnt通路成员表达的影响图；

图6为Wnt通路激活剂(LiCl)对水牛卵母细胞成熟率的影响图；

图7为Wnt通路激活剂(LiCl)对水牛胚胎分裂率的影响图；

图8为Wnt通路激活剂(LiCl)对水牛胚胎囊胚率的影响图。

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例1：

本实施例为Wnt/β-catenin信号家族成员对水牛卵巢功能的影响研究：

根据前人的研究经验，目前现有技术中有报道：Wnt/β-catenin信号家族成员是卵巢功能调控的重要因素，Wnt通路影响雌激素的生成并调控FSH的作用。在牛优势卵泡选择期，Wnt通路的CTNNB1基因、AXIN2基因和DVL1基因的表达都受到短暂调控，证明Wnt通路调节FSH诱导的雌二醇生成，参与卵泡发生。有研究表明LH处理牛黄体细胞也会引起CTNNB1升高，下调Wnt信号通路成分表达，增加孕酮含量。我们之前的研究也报道了优势化早期，最大卵泡中的DVL1和FZD6的mRNA表达水平高于，而AXIN2低于次大卵泡，为此，申请人利用Wnt的抑制剂处理水牛颗粒细胞，研究抑制剂对相关基因和雌激素的影响，具体结果参见图1-图3：

图1为Wnt经典通路抑制剂(IWR-1)对基础的和FSH诱发的颗粒细胞E2生成和增殖的影响图；；

图中A为：Wnt经典通路抑制剂(IWR-1)对基础和FSH诱发的颗粒细胞E2生成能力的影响；

B为：Wnt经典通路抑制剂(IWR-1)对基础和FSH诱发的颗粒细胞增殖能力的影响。

图2为Wnt经典通路抑制剂(IWR-1)对FSH靶基因mRNA表达的影响图；

图中A为：1μM的Wnt通路抑制剂(IWR-1)对CYP19A1在mRNA表达水平的影响；

B为：1μM的Wnt通路抑制剂(IWR-1)对CCND2在mRNA表达水平的影响；

C为：1μM的Wnt通路抑制剂(IWR-1)对CARTPT的mRNA表达水平的影响。图3为Wnt经典通路抑制剂对Wnt通路活性的影响图；

图中A为：Wnt通路抑制剂(IWR-1)对Wnt通路成员AXIN2蛋白表达量的影响；

B为：Wnt通路抑制剂(IWR-1)对Wnt通路成员CTNNB1蛋白表达量的影响；

C为：不同条件下IWR-1处理后AXIN2和CTNNB1蛋白及看家蛋白ACTIN的蛋白免疫印迹图。

以上的研究说明Wnt通路通过调控颗粒细胞的功能参与了水牛卵泡优势化。而与此同时，文献报道在体外培养条件下牛卵母细胞和卵丘细胞的β-catenin含量都会升高，体外阻断Wnt通路可以阻断卵母细胞从GV期发育到MII期，说明Wnt信号通路是牛卵母细胞成熟所必需的。Wnt通路的作用在物种间却有很大差异。因此我们进一步研究了Wnt通路对水牛卵母细胞发育潜能的影响。

当添加1μM的Wnt通路抑制剂(IWR-1)后，对水牛卵母细胞的影响如图4-图5所示：

其中，图4为Wnt经典通路抑制剂(IWR-1)对水牛卵母细胞成熟效果的影响图；

从图4中可见，对照(Control组)的水牛卵母细胞成熟率显著高于抑制剂(IWR-1)组，其中，对照(Control组)的成熟率为59.46±10.42％；抑制剂(IWR-1)组的成熟率为19.69±7.97％。

而图5为Wnt经典通路抑制剂(IWR-1)对水牛卵母细胞内Wnt通路成员表达的影响图；

从图中可见，抑制剂(IWR-1)组添加后，显著降低了其中的Wnt通路成员的mRNA表达水平，且差异显著(p<0.01)。

而这与现有技术《WNT信号通路对猪卵母细胞体外成熟的影响》一文中记录的“WNT/β-catenin特异性抑制剂FH535可以促进猪卵母细胞的成熟及提高其早期胚胎发育的能力”(该文摘要部分)的结论相反，由此，更加推定，不同物种之间Wnt通路对卵母细胞发育的影响是不一样的。

而根据Wnt通路抑制剂(IWR-1)对水牛卵母细胞成熟效果有抑制作用，由此我们推断Wnt通路的激活剂可以促进水牛卵母细胞的成熟率，从而提高卵母细胞受精后的发育潜能，继而提高水牛体外胚胎的生产效率。

实施例2：

根据实施例1的研究发现：Wnt经典通路抑制剂(IWR-1)对水牛卵母细胞的成熟率有降低作用，为此，为了提高水牛卵母细胞的成熟率从而提高水牛体外胚胎的生产效率，申请人采用Wnt通路激活剂---LiCl(氯化锂)来促进水牛卵母细胞成熟，提高水牛的体外胚胎生产效率，具体的步骤如下：

1、卵母细胞的获取：

将屠宰场卵巢或活体采卵获得的水牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)按照一下标准分级：A级：卵胞质均匀且包裹4层以上卵丘细胞；B级：卵胞质均匀且包裹3-4层卵丘细胞；C级：卵胞质均匀且包裹1-2层卵丘细胞；D级：裸卵；E级：卵丘细胞扩散成网状。挑选A-C级的COCs进行体外成熟培养。

2、成熟培养液的准备：

常规的对照组成熟培养液为(Control组)：体积百分比为10％的胎牛血清(FBS)、5ng/mL的卵泡刺激素(FSH)、10ng/mL的黄体生成素(LH)、0.2mM的丙酮酸钠、1μg/mL的雌二醇(E

LiCl组成熟培养液为(LiCl组)：体积百分比为10％的胎牛血清(FBS)、5ng/mL的卵泡刺激素(FSH)、10ng/mL的黄体生成素(LH)、0.2mM的丙酮酸钠、1μg/mL的雌二醇(E

3、卵母细胞的成熟：

每10-20个COCs转入覆盖石蜡油的40μL的成熟卵培养液(IVM液)微滴内，在38.5℃、5％CO

4、体外受精：

将0.25mL的细管冻精解冻后在爬高液中培养30min，取上清夜260g离心5min，而后用受精液(IVF液)离心洗涤一次，然后加入40μL含卵母细胞的受精液(IVF液)滴中，调整精子浓度约为1×10

上述步骤中，爬高液由如下成分组成：质量百分数为0.3％的牛血清蛋白(BSA)，余量为改良的台式液(Tyrode’s液)：其中，台式液(Tyrode’s液)由如下成分组成：113.8NaCl+3.2mM KCI+0.3mM NaH

受精液(IVF液)由如下成分组成：60μg/mL肝素钠、质量百分数为0.3％的牛血清蛋白(BSA)，余量为改良的台式液(Tyrode’s液)：其中，台式液(Tyrode’s液)由如下成分组成：113.8NaCl+3.2mM KCI+0.3mM NaH

5、卵丘细胞单层液的准备：

将屠宰场获得的水牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)成熟培养24h后，取2-3个扩展良好的水牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，转入覆盖石蜡油的40μL胚胎培养液微滴内，用100μL枪头吹打使卵丘细胞均匀分布于微滴内，培养2-4天，使卵丘细胞在微滴内生长到100％汇集，用作胚胎培养用卵丘细胞单层液。

其中，上述的胚胎培养液由如下成分组成：体积百分比为10％的胎牛血清(FBS)；余量为TCM199培养液。

6、体外胚胎培养：

将步骤4受精后的受精卵用胚胎培养液清洗3次后，用步骤5的卵丘细胞单层液替代胚胎培养液对清洗后的受精卵进行胚胎培养，在38.5℃、5％CO

上述培养得到的结果如图6-图8所示：

图6为Wnt通路激活剂(LiCl)对水牛卵母细胞成熟率的影响图：

从图中可见，成熟液添加LiCl后卵母细胞成熟率达到90.01±9.33％；显著高于未添加LiCl的Control组(59.59±10.42％)(p<0.01)；

图7为Wnt通路激活剂(LiCl)对水牛胚胎分裂率的影响图：

从图中可见，添加LiCl成熟的卵母细胞受精后分裂率达到65.22±7.45％；显著高于未添加LiCl的Control组(48.78±6.92％)(p<0.01)；

图8为Wnt通路激活剂(LiCl)对水牛胚胎囊胚率的影响图：

从图中可见，添加LiCl成熟的卵母细胞受精后培养的囊胚率达到47.38±3.75％；显著高于未添加LiCl的Control组(27.07±3.60％)(p<0.01)。

综上所述，本申请的Wnt通路激活剂LiCl能有效提高水牛卵母细胞的成熟率、水牛胚胎的分裂率和水牛胚胎的囊胚率，有效提高了水牛体外胚胎生产效率。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。