预示荷斯坦奶牛乳房炎乳源外泌体miRNA诊断标志物

摘要

本发明公开了一种预示荷斯坦奶牛乳房炎乳源外泌体miRNA诊断标志物，是以乳源外泌体miR‑223和miR‑200b做为荷斯坦奶牛乳房炎的诊断标志物；成功分离和鉴定荷斯坦奶牛乳源外泌体；荷斯坦奶牛乳房炎个体外泌体中miR‑223的水平较对照组显著增加(P＜0.001)；miR‑200b的水平较对照组显著降低(P＜0.001)。由于在外泌体的提取过程中，绝大部分蛋白成分被去除，泌体miRNA较牛奶miRNA可以更为准确地反映奶牛个体是否患乳房炎。

说明书

技术领域

本发明涉及一种预示荷斯坦奶牛乳房炎的诊断标志物，进一步讲是提供了以乳源外泌体miR-223/miR-200b作为诊断标志物对荷斯坦奶牛乳房炎进行早期诊断，属于奶牛疾病生物诊断技术领域。

背景技术

奶牛乳房炎是世界公认的奶牛三大疾病之一，导致奶牛暂时或永久性降低产奶量和牛奶品质、延长产后发情周期、失去繁殖性能等。长期以来，奶牛乳房炎对奶牛养殖业造成的经济损失位居各类疾病之首，是乳制品行业中高成本的疾病。

据报道全球存栏的2.2 亿头奶牛约有三分之一患有乳房炎及隐形乳房炎，发病率很高且不同国家和地区奶牛乳房炎的发病率存在一定差异。乳房炎是乳房组织的炎症，可由各种感染因子引起，通常是由金黄色葡萄球菌、乳房链球菌和大肠杆菌等病原体引起的微生物感染的结果，是一种以临床表现为乳房局部变化和乳汁分泌异常的慢性或急性疾病，它的特点是体细胞数量升高，通常伴有牛奶的物理、化学或微生物的变化。

随着生物进化过程，原核生物和真核生物均已进化出简洁而高效的细胞间通讯策略。经典的细胞生物学认为，细胞间通讯有二种方式，通过直接接触相互作用或者分泌可溶性因子如激素、生长因子、细胞因子等间接作用。近几年的研究发现，外泌体作为第三种新发现的重要的细胞间通讯载体，能够介导细胞之间蛋白质、脂质和核酸等生物大分子的转运，广泛影响机体的生理病理过程。外泌体是指不同类型细胞分泌的由磷脂双分子层膜包裹蛋白质、脂质和核酸形成的囊泡结构，能够在细胞间转运蛋白质、脂质和核酸，是介导细胞间通讯的有力载体。miRNA存在于各种体液中，并选择性地包装在外泌体内，这是一种由大多数细胞类型分泌的膜囊泡。这些外泌体miRNA可以被主动递送到受体细胞中，并且可以调节靶基因表达和受体细胞功能。外泌体天然存在于各种体液中，如血液、尿液、唾液、脑脊液和乳汁，为其广泛调控机体生理病理过程提供了基础。

发明内容

本发明公开一种作为预示荷斯坦奶牛乳房炎的诊断标志物，是以乳源外泌体miR-223和miR-200b做为诊断标志物对荷斯坦奶牛乳房炎进行早期诊断，解决了现有技术中对荷斯坦奶牛乳房炎检测的不足。

本发明公开的一种预示荷斯坦奶牛乳房炎的诊断标志物，其特征在于所述的诊断标志物为：乳源外泌体miR-223和miR-200b；其中，

miR-223诊断标记序列如SEQ no.1所示；

miR-200b诊断标记序列如SEQ no.2所示。

本发明所述的一种以乳源外泌体miR-223和miR-200b做为诊断标志物预示荷斯坦奶牛乳房炎的早期诊断方法，包括以下步骤：

1、将奶样分梯度低速离心进行：

300×g/min、10 min；3000×g/min、20 min；10000×g/min、30 min离心收取上清；

再行梯度超速离心30000×g/min、60 min；50000×g/min、90min；70000×g/min、90 min；95000×g/min 60 min；120000×g/min 、90min；120000×g/min、90 min；

其中奶样在50000×g/min离心后取三分之二上清以3μm滤膜过滤后再行70000×g/min离心，取三分之二上清以1μm和0.45μm的滤膜过滤，最后95000×g/min离心后取三分之二上清以0.22μm的滤膜过滤，再行120000×g超速离心，收集乳源Exosomes。

2、根据牛miR-223和miR-200b基因和启动子序列设计的两对引物引物序列如下：

miR-223：

F-primer TGCGGTGTCAGTGTCAAAT，

R-primer CAGTGCAGGGTCCGAGGT；

miR-200b：

F-primer TGCGGTAATACTGCCTGGTA，

R-primer CAGTGCAGGGTCCGAGGT。

3、将步骤1）分离的泌乳奶牛乳源Exosomes，用TRIzol法提取外泌体总RNA，用反转录试剂盒将乳源Exosomes总RNA反转录成cDNA进行RT-qPCR检测泌乳奶牛样品间miR-223和miR-200b丰度水平；

反应体系为步骤2）设计的miR-223和miR-200b上游引物各0.5μL，下游引物各0.5μL，cDNA 1μL，ddH

反应条件为：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 10s，60℃ 30s（45个循环）；95℃ 15s；55℃ 15s；95℃ 15s。

本发明将分析牛奶特异性的miR-223和miR-200b在荷斯坦奶牛乳源外泌体中的表达，并探讨其作为奶牛乳房炎标志物的可能性。

采用优化后的超速离心法分离提取乳源外泌体，实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术分析牛奶特异性的miR-223和miR-200b在患乳房炎个体和健康个体乳源外泌体中的表达和差异。miR-223和miR-200b的特异性和灵敏度显著高于现有的乳房炎检测技术。

本发明的积极效果在于：

公开了乳源外泌体miR-223和miR-200b做为荷斯坦奶牛乳房炎的诊断标志物；成功分离和鉴定荷斯坦奶牛乳源外泌体；荷斯坦奶牛乳房炎个体外泌体中miR-223的水平较对照组显著增加(P＜0 .001)；miR-200b的水平较对照组显著降低(P＜0 .001)。由于在外泌体的提取过程中，绝大部分蛋白成分被去除，因此外泌体miRNA较牛奶miRNA可以更为准确地反映奶牛个体是否患乳房炎。

附图说明

图1为乳源Exosome透射电镜下形态结构和粒径分布图及标志性蛋白CD81/TSG101鉴定；

图2为健康奶牛和乳房炎奶牛乳源外泌体miR-223/miR-200b表达水平。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

实施例1

一、乳样采集：

1.中国荷斯坦奶牛牛奶样品来自黑龙江北大荒牛场。选取2019年10月此牛场患乳房炎荷斯坦奶牛25例设为研究组，选取健康荷斯坦奶牛25例为对照组。

2.奶样收集与保存：采用洁净无菌的收集瓶收集牛奶样品，随后在实验室后立即分装到50 mL的离心管，逐步进行300×g 10 min、3 000×g 20 min、10 000×g 30 min的离心取上清，分别去除细胞、大颗粒干扰、脂肪等杂质后-80℃冻存。

二、乳源外泌体分离：

1、将保存于-80度的预处理的奶样在冰上融化，将奶样逐步进行300×g 10 min、3000×g 20 min、10 000×g 30 min的离心取上清，分别去除细胞、蛋白、脂肪等杂质。将样本再进行以下步骤，即30 000×g 60 min、5 0 000×g 90min、70 000×g 90 min, 95 000×g 60 min、120 000×g 90 min、120 000×g 90 min，其中50 000×g 离心后取三分之二上清使用3μm的滤器过滤、70 000×g 离心后取三分之二上清使用1μm和0.45μm的滤器过滤、95 000×g 离心后取三分之二上清过使用0.22μm的滤器过滤，再行120000×g超速离心。

2、分析外泌体的粒径和浓度：采Nanoparticle-tracking analysis(NTA)分析颗粒的数量和粒径分布。将上述沉淀用30ul无颗粒PBS重悬，测试前再稀释1000倍。

3、透射电镜观察外泌体的形态：将外泌体重悬液滴于200目铜网静止5min，然后用滤纸吸干液体，在经过1％磷钨酸负染2min，用PBS洗两次，透射电镜观察。透射电镜(JEM-2100JEOL ,Tokyo ,Japan)观察外泌体的形态和大小（参见图1）。

4、Westenblot检测外泌体标志物：采用RIPA(Pierce ,USA)裂解液提取外泌体蛋白，BCA(Pierce ,美国)测定蛋白浓度。12％SDS-PAGE分离蛋白，每道上样量为40ug总蛋白。湿转法将蛋白转移到PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入TSG101和CD81抗体(1:1000)，4℃封闭过夜，TBST洗3次每次5分钟，加入HRP标记的二抗(1:10000)，室温孵育1h，孵育完成后，经1×TBST多次清洗后，按1:1的比例配制显影液(ECL,Pierce ,USA)，将显影液慢慢滴加到PVDF膜上，铺满整张膜，再将多余显影液吸除，以免显影液过多造成背景太黑。曝光时间为5s，10s，15s，20s，30s。

由于牛奶中酪蛋白干扰严重，本发明在传统超速离心的基础上进行了优化，通过低速差速离心法除去牛乳中脂肪层、细胞和酪蛋白等分子量较大蛋白，最后通过超速离心法提取牛奶中外泌体。本实验通过该方法获得的乳源外泌体大致呈圆形、部分有凹陷，粒径在100nm左右，表达TSG101和CD81等外泌体的标志分子，且研究组和对照组间无明显差异。进一步的NTA分析显示，分离到的外泌体粒径并不均一，主要分布在100nm附近，说明成功分离了荷斯坦奶牛乳源外泌体。

三、乳源外泌体miR-223/miR-200b测定：

外泌体RNA抽提和定量及实时定量PCR：提取外泌体总RNA每200μL样本中加入1mL的TRIzol。将外泌体样品转移到1.5mL的EP管中，在15- 30℃放置5分钟。加入0.2 mL的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15- 30℃放置2-3分钟，然后离心 12,000×g，15分钟，2- 8℃。离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。RNA只存在于水相中。水相占总TRIzol的60%。将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入0.5mL异丙醇，并加入微量RNA助沉剂20 μL ，静置10分钟，15 -30℃，然后离心12,000×g，10分钟，2-8℃。离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。去上清，加入1mL75%冷乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500×g，5分钟，2-8℃。去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀。用无RNase水重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打几次，测浓度后-20℃保存。

用TaKaLa反转录试剂盒将所提取的组织RNA反转录成cDNA样品。反转录条件为：（1）RNA的变性：5×gDNA Eraser Buffer 2μL，gDNA Erase 1μL，1ug总RNA，把RNA样品放在42 ℃水浴锅热变性2 min，然后立刻置于冰上冷却。（2）反应液的配制：5×RT buffer 2μL；RT Enzyme mix 0.5μL；Prime mix 0.5μL；RNA 1μL，然后用Nuclear-free ddH

miR-223和miR-200b的定量引物序列分别为：

F-Primer TGCGGTGTCAGTGTCAAAT，

R-Primer CAGTGCAGGGTCCGAGGT；

F-Primer TGCGGTAATACTGCCTGGTA，

R-Primer CAGTGCAGGGTCCGAGGT；

内参基因U6引物序列为：

F-Primer CTCGCTTCGGCAGCACA，

R-Primer AACGCTTCACGAATTTGCGT。

使用反转录所得到的cDNA做模板，进行RT-qPCR。反应体系为上游引物各5μL，下游引物各5μL，cDNA 1μL，Mix 8μL，总体系10μL，每个样重复3次。反应条件为：50℃ 2min；95℃10min；95℃ 10s，60℃ 30s（45个循环）；95℃ 15s；55℃ 15s；95℃ 15s。反应完成后应用SPSS分析所得到的数据。

试验例1

研究组乳源外泌体中miR-223/miR-200b的表达：

采用Q-PCR检测乳源外泌体中miR-223和miR-200b（如图2所示），研究组患乳房炎个体乳源外泌体中miR-223的表达丰度显著升高(P＜0 .001)，miR-200b的表达丰度显著降低(P＜0.001)。因此它们可作为荷斯坦奶牛乳房炎诊断的标志物，并且本发明公开的miR-223和miR-200b的特异性和灵敏度显著高于现有的乳房炎检测技术。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 预示荷斯坦奶牛乳房炎乳源外泌体miRNA诊断标志物

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> 牛(Bos taurus)

<400> 1

gcaggcaaaa cccca 15

<210> 2

<211> 14

<212> DNA

<213> 牛(Bos taurus)

<400> 2

aaacgccgga agag 14

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

tgcggtgtca gtgtcaaat 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

cagtgcaggg tccgaggt 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

tgcggtaata ctgcctggta 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

cagtgcaggg tccgaggt 18