亲油疏水高活性负载微生物向日葵花盘多孔材料的制备方法与应用

摘要

本发明属于化学应用领域，具体涉及亲油疏水特性的高活性负载微生物向日葵花盘多孔材料的合成方法与应用；本发明以亲水超轻改性、多次浓缩负载微生物、亲油疏水选择性改性为主要手段，介绍了的亲油疏水高活性负载微生物向日葵花盘多孔材料的合成方法。其次研究了其在石油烃模拟油正十六烷中的降解性能。此外，本发明采用粘连剂多次浓缩固定化微生物和选择性吸附疏水改性对提高此材料的降解率起着关键性作用，并且材料本身具有的吸附性能利于增强其与模拟油正十六烷的接触率，通过对其应用的研究，初步认为本发明中制备的这类亲油疏水高活性负载微生物向日葵花盘多孔材料具有较好的降解正构烷烃特性，并且对周围劣势环境呈现出较强的耐受能力。

说明书

技术领域

本发明涉及多孔材料制备技术领域，具体涉及亲油疏水高活性负载微生物向日葵花盘多孔材料的制备方法与应用。

背景技术

石油是人类最主要的燃料来源之一，也是石油化工的基础。在开采过程中，石油及其相关污染物会进入土壤和水体，而石油中富含的苯系物和多环芳烃物质，会对土壤环境和地下淡水资源造成持久危害。因此，如何高效、绿色解决石油污染物问题已成为近年来学术界的研究热点。目前，修复石油污染最主要的方法有物理法，化学法和生物法，生物法中的固定化微生物技术是利用物理或化学手段将游离的微生物或者酶在限定的空间区域内，使微生物高度密集并保持生物活性功能，对石油等难生物降解的污染物有很强的处理能力。固定化微生物可保护细胞抵抗不利的环境条件，如pH、温度、盐度、湿度和营养元素等。向日葵花盘作为固定化微生物多孔材料具有良好的兼容性，绿色环保、可生物降解，为生物提供良好的微环境，价格低廉等优点。

目前，关于固定化微生物降解石油烃的相关研究已较为成熟，研究通常以包埋和吸附的方式固定化微生物，其具有微生物固定量较少，吸附方式结合力弱等缺点。研究者们往往还忽视了固定化微生物材料的重要性，材料不具备机械性强可循环使用、吸附量大可提高微生物活性和亲油性好可选择性吸附等优势性能。因此，制备出一种具有高活性高性能的负载微生物多孔材料用于降解正构烷烃性能研究成为了近年来的研究热点。

发明内容

本发明的目的在于提供一类亲油疏水高活性负载微生物向日葵花盘多孔材料的制备方法及其应用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

亲油疏水高活性负载微生物向日葵花盘多孔材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：菌悬液的培养

挑取活化后的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，BTS）约100μL接种于无菌的营养肉汤培养基中，37℃、120 r/min进行振荡增殖培养；48 h后观察其是否变浑浊，且通过血球计数板法观察菌种数量，保证菌种数量达到1×10

步骤二：制备亲水超轻改性向日葵花盘多孔材料

(1)将干燥的向日葵花盘（命名为SFT）切成块状放入烧杯中，加入NaClO

(2)反应2h后，加入NaClO

(3)反应结束后冷却至室温，洗涤过滤，调节pH至中性；

(4)冷冻干燥48 h得改性材料，命名为MSFT；

步骤三：制备负载微生物（命名为BTS）多孔材料

将步骤一得到的MSFT在121℃下高压蒸汽灭菌30min，冷却至室温后备用；

将其浸入聚乙烯醇（PVA）溶液中，直至完全湿润，抽滤去除多余PVA，并用蒸馏水冲洗其表面，防止外壁孔道堵塞；

在MSFT中加入定量的菌悬液放置30 min左右，直至完全吸收；

再将负载微生物BTS后的多孔材料在37～40℃下干燥2 h，此时菌剂已浓缩负载在PVA表面或包裹其中，取出后加入Ca(NO

最后再抽滤出多余的Ca(NO

如此重复将（3）-（5）操作4次，1、2、3、4次负载微生物BTS后的载体分别命名为BTS-MSFT1，BTS-MSFT2、BTS-MSFT3，BTS-MSFT4；

步骤四：制备亲油疏水高活性负载微生物向日葵花盘多孔材料

（1）取步骤二得到的负载4次石油烃降解菌BTS的材料（BTS-MSFT4）做为后续亲油疏水改性材料；

（2）在含有环氧树脂的烧杯中加入丙酮，充分搅拌溶解，其后加入甲基三甲氧基硅烷（MTMS）混合均匀喷涂在BTS-MSFT4表面；

（3）将疏水亲油改性后的材料命名为BTS-MSFT4@MTMS。

优选的，在步骤二的（1）中，所述NaClO

优选的，在步骤二的（1）中，所述的向日葵的块状尺寸为2×2.5cm。

优选的，在步骤二的（1）中，所述的重复操作的次数为4次。

优选的，在步骤三的（2）中，所述PVA的浓度为3%。

优选的，在步骤三的（3）中，所述MSFT中加入定量的菌悬液，第1、2、3、4次加入的量分别为：4.0853 g、1.92144 g、0.79963 g、0.68965 g。

优选的，在步骤三的（4）中，所述Ca(NO3)2·4H2O的浓度为5%，加入量为20mL。

优选的，在步骤四的（2）中，所述环氧树脂加入量为16 g，丙酮的加入量为10 mL，所述疏水改性试剂MTMS的量为10mL。

亲油疏水高活性负载微生物向日葵花盘多孔材料的应用，将上述亲油疏水高活性负载微生物向日葵花盘多孔材料用于降解模拟油正十六烷的性能研究。

优选的，所述正十六烷的质量浓度为3 %（相对于菌悬液质量）

优选的，所述底物为3 %正十六烷和30 mL去离子水混合物。

本发明具有以下有益效果：

首先，本发明以亲水超轻改性、多次浓缩负载微生物、亲油疏水选择性改性为主要手段，介绍了的亲油疏水高活性负载微生物向日葵花盘多孔材料的合成方法；其次，本发明研究了其在石油烃模拟油正十六烷中的降解性能；最后，本发明采用粘连剂多次浓缩负载微生物和选择性吸附疏水改性对提高此材料的降解率起着关键性作用，并且材料本身具有的吸附性能利于增强其与模拟油正十六烷的接触率，通过对其应用的研究，初步认为本发明中制备的这类亲油疏水高活性负载微生物向日葵花盘多孔材料具有较好的降解正构烷烃活性，并且对周围劣势环境呈现出较强的耐受能力，具有一定的实际应用价值。

附图说明

图1是本发明的亲油疏水高活性负载微生物向日葵花盘多孔材料的制备路线图；

图2(a)、图2(b) 为本发明实施例1中的SFT亲水超轻改性前后接触角测试图；

图2(c)为本发明实施例1中的 MSFT超轻感官图；

图2(d)为本发明实施例1中的MSFT扫描电子显微镜（SEM）图；图3(a)为本发明实施例2中的负载微生物BTS数量柱状图；

图3(b)为本发明实施例2中的平板计数图；

图4(a)为本发明实施例3中 BTS-MSFT4@MTMS的接触角；

图4(b)为本发明实施例3中BTS-MSFT4@MTMS的X射线光电子能谱图(XPS)；

 图5为本发明实施例4中BTS-MSFT4 和BTS-MSFT4@MTMS的GC原图；

图6为本发明实施例4中 BTS的GC原图；

图7为本发明实施例4中BTS,MSFT,BTS-MSFT4和BTS-MSFT4@MTMS在不同降解时间下的降解率。

实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

本发明的亲油疏水高活性负载微生物向日葵花盘多孔材料的制备路线图1所示；

具体制备方法如下：

实施例一：亲水超轻改性向日葵花盘多孔材料的制备

将干燥的向日葵花盘（命名为SFT）切成2×2.5 cm 放入烧杯中，加入1 % NaClO

如图2(a)、图2(b)所示，对MSFT进行接触角表征，可见亲水超轻改性后，疏水角由150º变为0º。

如图2(c)所示，其在花蕊上的感官图证明改性后的向日葵花盘具有超轻性能。

如图2(d)所示，MSFT表面疏松多孔，且均为大孔，符合吸附微生物需要的尺寸。

实施例二：固定化微生物多孔材料的制备

（1）MSFT合成：同实施例一。

（2）将MSFT在 121℃下高压蒸汽灭菌30 min，冷却至室温后备用。将其浸入3%质量浓度的PVA溶液中，直至完全湿润，抽滤去除多余PVA，并用蒸馏水冲洗其表面，防止外壁孔道堵塞。随后，MSFT中加入定量的菌悬液（第1、2、3、4层的量分别为：4.0853g、1.92144g、0.79963g、0.68965g）放置30 min左右，直至完全吸收。再将负载微生物BTS后的多孔材料在37～40℃下干燥2 h，此时菌剂已浓缩负载在PVA表面或包裹其中，取出后加入20 mL 5%的Ca(NO3)2·4H2O溶液，4 ℃下反应30 min。最后再抽滤出多余的Ca(NO

如图3（a）所示，随着负载次数的增加，4次后负载量逐渐趋于稳定。所以，综合分析后，本发明选用4次为最佳负载次数。

如图3（b）所示，平板活菌计数显示负载微生物后的材料BTS-MSFT4活菌数为1.15×10

实施例三：亲油疏水高活性负载微生物向日葵花盘多孔材料的制备

（1）BTS-MSFT4的制备：同实施例二。

（2）在含有16 g环氧树脂的烧杯中加入10 mL丙酮，充分搅拌溶解，其后加入10 mL甲基三甲氧基硅烷混合均匀喷涂在BTS-MSFT4表面。将疏水亲油改性后的材料命名为BTS-MSFT4@MTMS。

如图3(a)所示，亲油疏水改性后的材料BTS-MSFT4@MTMS疏水角达到110º，表明亲油疏水改性成功。

如图3(b)所示，改性前BTS-MSFT4中主要含元素C1s、O1s，亲油疏水亲油改性后，XPS谱图中增加了元素Si2p和Si2S，表明MTMS已成功附着在BTS-MSFT4表面，形成了高性能BTS-MSFT4@MTMS多孔材料。

实施例四：本发明的亲油疏水高活性负载微生物向日葵花盘多孔材料在降解正构烷烃方面的应用

在50mL锥形瓶中加入30ml去离子水和3%（相对于菌剂固定量），将前期制备完成复活后的BTS-MSFT4@MTMS投入其中，在37℃、120 r/min、pH=7等条件下降解12h、24h、72h、120h、192h。分别通过GC（Clarus GC-TotalChrom，美国珀金埃尔默仪器（上海）有限公司）对其进行定量分析，通过标准曲线计算其降解率。GC的测量条件为：柱温为180℃；维持2min，进样器和FID检测器温度均为220℃。氮气，氢气和空气的固定流速分别为20、45和450 mL /min。

如图5和图6所示，分别为BTS和BTS-MSFT4、BTS-MSFT4@MTMS的GC原图，从图中可清晰的看出峰面积均随时间而减少，BTS-MSFT4@MTMS在192h时，其峰面积比其他组峰面积减少的更多，证明正十六烷的残余量低，BTS-MSFT4@MTMS对正十六烷降解率高。

如图7所示，在初始浓度3%、pH=7、37℃的条件下，BTS-MSFT4（实验组1）、BTS-MSFT4@MTMS（实验组2）、BTS（对照组）和MSFT（空白组）对比发现，随着降解时间的增加，降解率逐渐变高，降解120h后，BTS-MSFT4、BTS-MSFT4@MTMS的降解率均呈现趋于稳定的趋势，192h 时BTS-MSFT4@MTMS降解率达到最大86.65%，BTS-MSFT4达到81.62%，对照组BTS在24h后趋于稳定。

分析以上结果可能的原因是，当游离的BTS刚进入含有3%模拟油正十六烷的水油混合物时，由于细菌生长繁殖需要营养物质，则快速吸收降解正十六烷以获得能量，或经过同化作用将正十六烷转化为自身的组成物质，降解后期由于碳源不足导致微生物大量死亡，降解率趋于低值并延续。分析空白组降解曲线表明，材料本身具有吸附效果，可有效提高BTS-MSFT4和BTS-MSFT4@MTMS微环境中的生物有效浓度，利于提高其与模拟油正十六烷的接触率，从而增强降解率。负载微生物BTS后的多孔材料BTS-MSFT4内部具有丰富的孔隙结构，降解菌群存在其内部的孔隙中，可以避免外界不良因素的影响，为微生物提供适宜生存的微环境，且材料本身含有的营养元素，可以直接供给降解菌BTS吸收，促进降解菌BTS的生长。同时本研究负载微生物的方式弥补了传统吸附法结合力弱的不足，采用PVA将其牢固的负载在材料孔隙上，再通过Ca

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。