一种基于肿瘤自身微环境提高基因转染效率的纳米颗粒及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种基于肿瘤自身微环境提高基因转染效率的纳米颗粒，首先通过溶胶凝胶法化学合成介孔硅纳米颗粒，然后掺入金属离子以及通过聚乙烯亚胺对金属离子介孔硅纳米颗粒进行表面改性，得到了MMSNs‑P，最后将其与葡萄糖氧化酶、核酸药物混合，得到GR@MMSNs‑P，即基于肿瘤自身微环境提高基因转染效率的纳米颗粒。该纳米颗粒克服了光化学转染技术中激光穿透深度浅的缺陷，将“饥饿”/基因疗法相结合，利用肿瘤微环境来提高基因转染效率，为肿瘤的治疗提供新的思路。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种基于肿瘤自身微环境提高基因转染效率的纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术可抑制特定基因的表达来发挥基因治疗效果，具有特异性高、安全性高、沉默效率高、作用稳定等优势，在肿瘤治疗方面展现了诱人的应用前景。研究显示，纳米递送系统(DDS)可保护基因免受降解，提高体内循环时间，并增强癌细胞对基因的摄取，提高基因转染效率。然而，外源RNA进入细胞后易困于溶酶体内，难以进入细胞质发挥作用，影响转染效果，因此，RNA的溶酶体逃逸是研究需解决的一大难题。

光化学转染技术为实现RNA的溶酶体逃逸提供了新思路，其作用机制是：在激光激发下光敏剂产生活性氧(ROS)，破坏溶酶体膜，促进基因的溶酶体逃逸。例如专利CN108524946A公开了包含的光敏剂可以在外源红光控制下，产生活性氧(ROS)，实现光化学内在化(PCI)介导的溶酶体逃逸，以及光促进的聚合物降解，最终实现降低材料毒副作用，提高转染效率，增强肿瘤基因治疗效果的目的。但由于激光穿透深度浅，难以治疗深层肿瘤，该技术受到很大限制，且需要额外使用光敏剂。新兴的化学动力学疗法是利用芬顿(Fenton)或类芬顿反应催化肿瘤组织中过表达的H

发明内容

本发明的第一个目的在于克服现有技术中存在的基因治疗转染效率低且PCI激发光组织穿透深度浅且肿瘤微环境中H

本发明的第二个目的在于提供所述基于肿瘤自身微环境提高基因转染效率的纳米颗粒的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供所述基于肿瘤自身微环境提高基因转染效率的纳米颗粒的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种基于肿瘤自身微环境提高基因转染效率的纳米颗粒，由表面修饰有聚乙烯亚胺的掺杂金属离子的介孔硅纳米颗粒(MMSNs-P)与包载在介孔硅纳米颗粒中的核酸药物、葡萄糖氧化酶(GOx)组成。

本发明的基于肿瘤自身微环境提高基因转染效率的纳米颗粒中，所述表面修饰有聚乙烯亚胺的掺杂金属离子的介孔硅纳米颗粒作为核酸药物和GOx的载体，所述金属离子用于参与芬顿反应，所述PEI为转染试剂，所述GOx作为提升肿瘤内H

优选地，所述纳米颗粒的粒径为50～400nm。

优选地，所述金属为Fe、Cu、或Mn中的一种或多种。

优选地，所述核酸药物为DNA、RNA，更优选为小干扰RNA(siRNA)。

优选地，所述由表面修饰有聚乙烯亚胺的掺杂金属离子的介孔硅纳米颗粒、GOx、核酸药物的质量比为15～200：1～40：1～4，

更优选地，所述由表面修饰有聚乙烯亚胺的掺杂金属离子的介孔硅纳米颗粒、GOx、核酸药物的质量比为15～120：1～30：1～4。

本发明还提供上述任一所述的纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

S1.利用溶胶－凝胶法制备介孔硅纳米颗粒，然后与金属离子化合物在碱性条件下反应，高温水热法得到掺金属离子的介孔硅纳米颗粒(MMSNs)；

S2.将步骤S1中得到的MMSNs进行氨基化改性，再进行羧基化改性，得到羧基化掺金属离子的介孔硅纳米颗粒，再将其滴加入PEI乙醇溶液，PEI与羧基化掺金属离子的介孔硅纳米颗粒表面发生偶联反应，得到MMSNs-P；

S3.将GOx与步骤S2得到的MMSNs-P搅拌均匀得到装载GOx的纳米粒，然后加入核酸药物混合均匀，静置即得。

优选地，所述步骤S1中介孔硅纳米颗粒、金属离子化合物与碱性物质的质量比是5～50:8～30:10～30。

更优选地，所述步骤S1中金属离子化合物为含Fe

优选地，所述步骤S2所述氨基化改性的试剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)。

优选地，所述步骤S2羧基化改性的试剂为丁二酸。

优选地，所述步骤S2中MMSNs、氨基化改性试剂与羧基化改性试剂的质量比为1～3：8～30～2～7。

作为一种优选地可实施方式，所述纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将十六烷基三甲基氯化铵、超纯水和三乙醇胺混合搅拌，预热到45～95℃，缓慢加入正硅酸四乙酯，45～95℃搅拌反应3～6h，得到介孔硅纳米颗粒，用氯化钠的甲醇溶液萃取除去表面活性剂；在水溶液中，将介孔硅纳米颗粒与金属离子和碱性物质混合，高温水热反应得到MMSNs。

(2)向MMSNs的乙醇混合液中加入APTES，加热回流获得氨基化MMSNs(MMSNs-NH

(3)将MMSNs-P分散在水中，将其与GOx混合，搅拌均匀得到G@MMSNs-P，在涡旋条件下加入siRNA使混合均匀，静置，得到GR@MMSNs-P，即为基于肿瘤自身微环境提高基因转染效率的纳米颗粒。

优选地，步骤(1)中所述十六烷基三甲基氯化铵的量为1～6g，三乙醇胺的量为0.01～0.10g，水的体积为10～30mL。

优选地，步骤(1)中所述正硅酸乙酯的体积为0.5～5mL，萃取剂氯化钠的甲醇溶液浓度为5～15mg/mL，用量为100～200mL。

优选地，步骤(1)中所述高温水热反应条件为150～200℃，反应时间为24～72h。

优选地，步骤(2)中所述MMSNs的用量为50～150mg，APTES用量为0.2～5mL，回流温度为60～85℃，时间为8～15h。

优选地，步骤(2)中所述MMSNs-NH

优选地，步骤(2)中所述MMSNs-COOH、PEI、EDCI和HOBT的质量比为1.0～2.5：1.0～2.5：1.0～3：1.0～3，搅拌时间为24～48h。

优选地，步骤(3)中所述MMSNs-P、GOx和siRNA的质量比为15～120：1～30：1～4，搅拌12～24h，涡旋时间为20s～50s，静置0.5～2h。

本发明还提供上述一种基于肿瘤自身微环境提高基因转染效率的纳米颗粒在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明提供了一种基于肿瘤自身微环境提高基因转染效率的纳米颗粒，粒径可控，具有良好的生物相容性和生物可降解性，能够利用肿瘤微环境进行原位催化，在肿瘤微环境下消耗葡萄糖，提升肿瘤内H

附图说明

图1a和b为本发明实施例1中所得MMSNs的投射电镜(TEM)图。图1c为MMSNs的元素mapping图。

图2为本发明实施例1所得MMSNs的X射线光电子能谱(XPS)图。

图3为本发明实施例2MMSNs的降解性实验对应的TEM图。

图4为本发明实施例3中各合成物MMSNs、MMSNs-NH

图5为本发明实施例4的凝胶阻滞实验结果，图中有泳道1-7，泳道1：裸siRNA；泳道2-7：GR@MMSNs-P，质量比(G@MMSNs-P/siRNA)为1、5、10、15、20、30。

图6为本发明实施例5的RNA酶保护实验结果，图中有泳道1-8，泳道1：裸siRNA；泳道2：裸siRNA+RNase A酶；泳道3-4：GR@MMSNs-P，质量比为15、30；泳道5-6：GR@MMSNs-P(质量比15、30)+肝素钠；泳道7-8：GR@MMSNs-P(质量比15、30)+RNase A酶+肝素钠。

图7为不同浓度的GR@MMSNs-P对NP69细胞的毒性结果。

图8为MSNs、MMSNs、G@MMSNs-P、R@MMSNs-P以及GR@MMSNs-P对4T1细胞的增殖影响。

图9为MSNs、MMSNs和G@MMSNs-P对细胞内ROS产生的影响。

图10为GR@MSNs-P、GR@MMSNs-P对溶酶体逃逸的影响。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1掺杂锰的介孔硅纳米粒(MMSNs)的制备方法

取2g十六烷基三甲基氯化铵和0.02g三乙醇胺于18mL水中，在80℃下搅拌20min，缓慢逐滴加入1.5mL正硅酸四乙酯，继续在80℃下搅拌反应4h，离心收集沉淀，用水和乙醇洗两次后，加入100mL氯化钠的甲醇溶液(8mg/mL)萃取三次除去表面活性剂，再离心水洗收集产物；将320mg产物溶于10mL水中，向其中加入160mgMnSO

实施例2掺杂锰的介孔硅纳米粒(MMSNs)的降解性实验

在水浴搅拌37℃下，将10mg MMSNs分散于不同条件(pH值为7.4或5.5，谷胱甘肽，即GSH浓度为0或10mM)处理的模拟体液(SBF)中。在12h，24h，72h时，取1mL离心，沉淀重悬于乙醇，TEM观察。如图3所示，在模拟肿瘤微环境(酸性和高谷胱甘肽浓度)时，MMSNs降解性良好，72小时基本完全降解。

实施例3纳米颗粒(GR@MMSNs-P)的制备方法

(1)将50mg MMSNs溶于100mL乙醇中，加热到78℃，加入0.5mL APTES回流10h获得MMSNs-NH

(2)将10mg MMSNs-P分散于8mL水中，加入GOx水溶液(1mg/mL，2mL)，室温搅拌孵育24h，离心水洗得到G@MMSNs-P。将G@MMSNs-P(1mg/mL，200μL)置于涡旋仪上涡旋，缓慢加入siRNA(0.2mg/mL，50μL)，涡旋30s后，室温静置培育30min，得到GR@MMSNs-P。

实施例4凝胶阻滞实验

取50μLsiRNA(0.2mg/mL)水溶液，涡旋条件下缓慢滴加到200μL不同浓度的G@MMSNs-P溶液(0.05、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5mg/mL)中，涡旋30秒后，室温培育30分钟，得到不同质量比的GR@MMSNs-P。将裸siRNA作为对照组，把它们都与上样缓冲液混合后置于1％的琼脂糖凝胶上进行电泳实验，在Tris-Acetate-EDTA(TAE)缓冲液上80V、20分钟完成。如图5所示，G@MMSNs-P和siRNA的质量比为15以上时，载体能包载住siRNA。

实施例5RNA酶保护实验

为证明负电荷肝素钠可通过静电相互作用促进siRNA释放，将10μL质量比为15、30的GR@MMSNs-P复合物(包含0.4μg siRNA)加入5μL 150mg/mL的肝素钠溶液，50℃共孵育4h。取10μLsiRNA(0.4μg)和质量比为15、30的GR@MMSNs-P复合物(包含0.4μg siRNA)分别与40ng RNase A酶在37℃共孵育10分钟。RNase A酶通过添加RNase酶抑制剂被抑制。然后，加入肝素钠溶液进行同样孵育操作。将裸siRNA，裸siRNA+RNase A酶，GR@MMSNs-P(质量比15、30)，GR@MMSNs-P(质量比15、30)+肝素钠，GR@MMSNs-P(质量比15、30)+RNase A酶+肝素钠这八组分别进行1％琼脂糖凝胶电泳实验。如图6所示，肝素钠可促进复合物中siRNA释放(泳道5、6有条带跑出)，裸siRNA在RNase A酶作用下已降解，无条带(泳道2)，G@MMSNs-P可保护siRNA不被RNase A酶降解，在负电荷肝素钠的作用下siRNA可以被释放出来(泳道7、8)。

实施例6细胞毒性实验

(1)对正常细胞(人鼻咽上皮细胞)的毒性

细胞模型选用人鼻咽上皮细胞(NP69细胞)，核酸药物选用可抑制癌细胞转移的Twist siRNA。将不同浓度的GR@MMSNs-P与NP69细胞孵育48h，对照组为不加药的细胞，CCK8测定细胞毒性，由图7可知纳米颗粒GR@MMSNs-P对正常细胞基本无毒性。

(2)对4T1乳腺癌细胞的毒性

细胞模型选用4T1乳腺癌细胞，核酸药物选用可抑制癌细胞转移的Twist siRNA。将不同浓度的MSNs(不掺锰介孔硅)、MMSNs、G@MMSNs-P、R@MMSNs-P、GR@MMSNs-P与4T1细胞孵育48h，对照组为不加药的细胞，CCK8测定细胞毒性，由图8可知，随着给药浓度增加，由于“饥饿”/基因协同治疗作用，纳米颗粒GR@MMSNs-P能够有效抑制4T1乳腺癌细胞增殖。

实施例7细胞内ROS产生实验

将4T1细胞接种到激光共聚焦皿中，培养24h，更换新鲜完全培养液。向其中加入MSNs、MMSNs、MMSNs+H

实施例8溶酶体逃逸能力评价(溶酶体共定位实验)

以荧光标记的siRNA(FAM-siRNA)取代siRNA，制备载有FAM-siRNA的共输送纳米粒GR@MSNs-P、GR@MMSNs-P(前者不掺锰，后者掺锰)。将4T1细胞接种到激光共聚焦皿内，培养24h，更换新鲜完全培养液。向其中加入GR@MSNs-P、GR@MMSNs-P，使FAM-siRNA终浓度为200pmol/mL，孵育3、12h。采用Hoechst33342和Lyso Tracker Red染料分别标记细胞核和溶酶体，CLSM观察拍照。由图10可知，相同情况下，随时间推移，相比于不掺锰的体系(GR@MSNs-P)，掺锰的GR@MMSNs-P的溶酶体逃逸能力更强(FAM标记的siRNA和溶酶体荧光重合度小)。