一种具有免疫调控功能的牙周再生材料及其制备方法

摘要

本发明提出一种具有免疫调控功能的牙周再生材料，包括生物源性钙磷灰石颗粒和巨噬细胞极化诱导因子，所述巨噬细胞极化诱导因子负载于所述生物源性钙磷灰石颗粒上。本发明还提出所述的具有免疫调控功能的牙周再生材料的制备方法，第一步制备生物源性的钙磷灰石材料，筛选合适粒径用于后续巨噬细胞极化诱导因子的负载；第二步在制备的生物源性钙磷灰石表面通过涂覆聚多巴胺，再通过浸泡法实现巨噬细胞极化诱导因子的负载及缓慢释放。本发明将巨噬细胞极化诱导因子(如细胞因子、脂多糖)负载于生物源性钙磷灰石材料，旨在研发一种新型牙周免疫再生材料，即能稳定牙周缺损空间，又具备免疫调控功能，从而实现牙周多组织再生。

说明书

技术领域

本发明属于医用新材料领域，具体涉及一种具有免疫调控功能的牙周再生材料及其制备方法。

背景技术

牙周组织缺损是口腔颌面部的常见疾病，常常由重度牙周炎、肿瘤、外伤等引起，严重影响患者的口颌功能、面部美观和生活质量。牙周组织包括牙槽骨、牙骨质和牙周膜，结构复杂、层次多样，并包含软硬组织结构，其修复需要实现“牙槽骨-牙周膜-牙骨质”生理结构的多组织再生，是口腔研究领域的重点和难点，目前，引导组织再生技术（Guidedtissue regeneration, GTR）广泛应用于牙周缺损的临床治疗，取得了一定的疗效，但仍无法实现牙周多组织再生以恢复牙周组织生理结构的目标。因此，牙周多组织再生仍是口腔临床亟待解决的科学问题。

近年来，随着免疫研究的深入，免疫微环境在疾病的发生发展中的重要作用逐渐被揭示和应用，比如在肿瘤治疗领域和组织再生领域，免疫微环境的调控成为新的研究热点。调控缺损区域的局部免疫微环境、诱导内源性干细胞募集及多向分化、从而促进牙周缺损修复，可成为促进牙周多组织再生的新手段。

新近研究发现，巨噬细胞介导的免疫微环境是影响组织再生转归的关键细胞。巨噬细胞可以极化为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。M1型及M2型巨噬细胞极化诱导因子可以诱导巨噬细胞往不同极化表型转变，从而营造不同的免疫微环境，并介导不同的再生转归。如牙龈卟啉单胞菌,是与牙周疾病的发生发展关系密切的革兰氏阴性细菌，而牙龈卟啉单胞菌来源的脂多糖（

然而在牙周缺损的区域直接植入巨噬细胞极化诱导因子存在以下几个问题：（1）无法维持稳定再生空间及适配牙周缺损形态。牙周缺损通常狭小且不规则，表面往往存在软组织覆盖，为防止软组织塌陷并实现预期的再生效果，植入材料需要适应缺损形状、支撑缺损区域、提供稳定的再生空间。而常见的细胞因子制品往往为液体，无法起到防止软组织塌陷、支撑稳定缺损空间的作用；（2）难以缓慢释放以实现长期调控。牙周缺损修复为一较为长期的过程，需要长时间的调控。直接植入巨噬细胞极化诱导因子易造成局部初始浓度过高，反而不利于再生，并且短期快速地释放亦无法实现长期调节缺损局部的免疫微环境促进牙周多组织再生的目的，存在时效和量效不足的问题。

发明内容

为克服现有技术的局限性，基于调控免疫微环境促进牙周多组织再生这一策略，本发明旨在研发一种具有免疫调控功能的牙周再生材料并提出其制备方法，将巨噬细胞极化诱导因子（如细胞因子、脂多糖）负载于适配牙周缺损的生物源性钙磷灰石颗粒材料上，所得的新型牙周再生材料可稳定支撑牙周缺损空间、缓慢释放巨噬细胞极化诱导因子，通过调控牙周免疫微环境，实现牙周多组织再生调控。

本发明提出一种具有免疫调控功能的牙周再生材料，包括适配牙周缺损的生物源性钙磷灰石颗粒和巨噬细胞极化诱导因子，所述巨噬细胞极化诱导因子负载于所述生物源性钙磷灰石颗粒上；所述适配牙周缺损的生物源性钙磷灰石颗粒上覆盖有聚多巴胺涂层，所述巨噬细胞极化诱导因子负载在聚多巴胺涂层上；所述巨噬细胞极化诱导因子为IL4。

优选的，所述适配牙周缺损的生物源性钙磷灰石颗粒来源于动物硬组织，所述动物硬组织为骨。

优选的，所述适配牙周缺损的生物源性钙磷灰石颗粒来源于动物硬组织，所述动物硬组织为牙齿。

优选的，所述适配牙周缺损的生物源性钙磷灰石颗粒的来源包括有猪骨、牛骨、羊骨。

本发明还提出一种上述的具有免疫调控功能的牙周再生材料的制备方法，包括以下步骤：

S1、适配牙周缺损的生物源性钙磷灰石颗粒的制备

将脱脂脱蛋白的动物骨煅烧磨粒备用，筛选合适粒径用于后续巨噬细胞极化诱导因子的负载；

S2、巨噬细胞极化诱导因子的负载

在制备的生物源性钙磷灰石颗粒表面涂覆聚多巴胺形成超强粘性的表面，再通过浸泡法将聚多巴胺涂层涂覆的生物源性钙磷颗粒放入巨噬细胞极化诱导因子溶液中浸泡，实现巨噬细胞极化诱导因子的负载。

进一步的，S1的适配牙周缺损的生物源性钙磷灰石颗粒的制备包括以下步骤：

S1.1、选用新鲜动物硬组织，剥除表面软组织备用；

S1.2、依次使用30%的过氧化氢和无水乙醇各浸泡20-30h进行脱脂脱蛋白处理；

S1.3、超纯水漂洗20-30h；

S1.4、将骨块切成小块后在780-820℃下煅烧1.5-2.5h；

S1.5、超纯水震荡漂洗，于干燥箱中烘干，研磨成颗粒备用，可通过不同孔径的筛网，筛选适配牙周缺损粒径的生物源性钙磷灰石颗粒。

进一步的，S2的巨噬细胞极化诱导因子的负载包括以下步骤：

S2.1、称取一定量的Tris碱，加入去离子水，配制成0.01-0.1mol/L的Tris碱溶液；

S2.2、称取一定量的多巴胺-盐酸盐加入所述的Tris碱溶液，配置成1-10 mg/ml的多巴胺-盐酸盐Tris碱溶液，室温下调节pH值在7-12之间；

S2.3、将配得溶液滤菌处理后收集备用；

S2.4、往多巴胺-盐酸盐Tris碱溶液中加入准备涂层的生物源性钙磷灰石颗粒，放置在恒温摇床内，温度设置为20-40℃，转速为20-60rpm，12-48h后弃上层清液，去离子水洗涤多次，漂洗后离心处理，干燥后即得到聚多巴胺涂层的生物源性钙磷灰石颗粒；

S2.5、用细胞因子稀释剂配制1-10

S2.6、将聚多巴胺涂层涂覆、筛选得到的适配牙周缺损生物源性钙磷颗粒放入巨噬细胞极化诱导因子溶液中浸泡，放置于恒温摇床内，温度设置为2-6℃，转速为20-60rpm，12-48h后取出羟基磷灰石颗粒，转移到-20至-80℃冰箱中保存；

优选的，S2.5所述的细胞因子稀释剂包括但不限于牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲溶液、吐温20中的一种、两种或多种。

本发明的原理说明：

来自于动物骨骼或牙齿的生物源性钙磷灰石在化学成分、结构、骨吸收速率与人体矿化组织（如骨组织、牙体组织）更为相似，易于获取，可通过研磨和筛网制备不同粒径的颗粒适配不同牙周缺损形态的需要，植入缺损区域可支撑再生空间、防止缺损表面的软组织塌陷的作用，并在生物降解与生物相容性方面有着天然的优势。相较合成类钙磷灰石材料而言，生物源性的钙磷灰石材料保留了天然的矿化组织结构，疏松多孔，利于为细胞生长、迁移、黏附提供支架，并且具有较大的吸附面积，是具有良好发展前景的巨噬细胞极化诱导因子载体。有许多学者对诸如牛骨、猪骨、乌贼骨等在组织再生领域做了大量的临床研究，其中牛骨来源的羟基磷灰石已广泛在临床上投入使用；而猪骨拥有与人类骨组织最为相似的宏观和微观结构，亦是组织再生领域的热点材料来源。由此，本发明将采用生物源性钙磷灰石材料作为巨噬细胞极化诱导因子的载体和赋形材料，解决单纯巨噬细胞极化诱导因子无法支撑稳定再生空间的问题。

巨噬细胞极化诱导因子与生物源性钙磷灰石材料的结合需要满足两个条件：（1）巨噬细胞极化诱导因子可较牢固的负载于材料上；（2）其结合应是可逆的，植入体内后可释放于体内发挥效应。有研究表明，多巴胺是是贻贝黏附蛋白中的黏附功能单元，由于其含有大量的邻苯二酚和一、二级胺，在特定条件下即可自组装形成聚多巴胺膜，可在湿润的条件下牢固地粘附在几乎所有固体材料表面，因此广泛应用于生物医用材料表面的改性和生物活性因子的负载。聚多巴胺涂层也可有效黏附各种生物活性因子，并在植入体内后可实现因子的缓释；此外，多巴胺分子中含有丰富酚羟基和胺基，能够螯合生物源性钙磷灰石中的钙离子，与生物源性钙磷灰石材料形成牢固的结合，使其即使在聚多巴胺分子发生解离后也可结合于钙磷灰石材料上，有利于因子的进一步缓释；因此，本发明将进一步采用聚多巴胺涂覆生物源性钙磷灰石材料，负载巨噬细胞极化诱导因子，是其可缓慢释放实现长期调控，实现具有免疫调控功能的牙周再生材料的研发。

综上，本发明拟通过制备粒径可调的生物源性钙磷灰石颗粒适配不同牙周缺损形态的需求，在其表面涂覆聚多巴胺涂层后负载不同巨噬细胞极化诱导因子，从而形成具有免疫调控功能、稳定支撑牙周缺损空间的牙周再生材料，实现牙周多组织再生调控。

本发明的制备方案由两步构成，第一步制备具有不同粒径的生物源性的钙磷灰石材料，用于牙周后续巨噬细胞极化诱导因子的负载；第二步在制备的生物源性钙磷灰石表面涂覆聚多巴胺，再通过浸泡法实现巨噬细胞极化诱导因子的负载。本发明通过负载不同的巨噬细胞极化诱导因子，可赋予材料不同的免疫调控功能，从而得到既具备稳定空间的特性、又具备诱导免疫微环境特性的新型牙周再生材料。

本发明的有益效果具体体现在：

1、本发明采用的生物源性钙磷灰石材料生物相容性良好，可通过研磨和不同目数的筛网制备不同粒径的颗粒以适配不同牙周缺损形状的缺损，并且保留了骨组织疏松多孔的特征，利于细胞生长、迁移和黏附；具有较大的吸附面积，可实现巨噬细胞极化诱导因子的负载。

2、本发明将巨噬细胞极化诱导因子与制备的适配牙周缺损的生物源性钙磷灰石颗粒结合，具有一定的形态和机械强度，可以充填在牙周组织缺损部位防止缺损表面的软组织塌陷，可稳定空间，提供一定的形态支撑，在4周取材后通过Micro CT扫描与HE染色均可在制备的缺损区域发现新生组织在植入材料的周围形成，证明材料可以稳定固定于缺损区域调控牙周组织的再生。

3、负载不同巨噬细胞极化诱导因子的适配牙周缺损的生物源性钙磷灰石颗粒可以在局部营造不同的牙周免疫微环境，通过检测植入后3天局部的mRNA表达情况可知：负载LPS/IFNγ的钙磷灰石材料植入大鼠牙周缺损部位后，可营造M1型的免疫微环境，高表达M1样巨噬细胞的标志物；负载IL4的钙磷灰石材料植入大鼠牙周缺损部位后，可以营造M2型的免疫微环境，高表达M2样巨噬细胞的标志物。

4、本发明将几种负载有巨噬细胞极化诱导因子的生物源性钙磷灰石材料和未负载巨噬细胞极化诱导因子的材料分别植入大鼠牙周组织缺损中，可观察到植入负载有巨噬细胞极化诱导因子的生物源性钙磷灰石材料的牙周缺损在4周后观察到有牙周多组织（牙槽骨-牙周膜纤维-牙骨质复合体）的再生，而植入未负载巨噬细胞极化诱导因子的钙磷灰石材料的大鼠牙周缺损组织中并未观察到此现象。

附图说明

图1为本发明的具有免疫调控功能的牙周再生材料的制备过程示意图。

图2为不同粒径的生物源性钙磷灰石材料应用于大鼠牙周缺损模型示意图。其中a图的粒径为＜0.2mm；b图的粒径为0.2-1mm；c图为1-2mm；d图为＞2mm。

图3为生物源性羟基磷灰石材料聚多巴胺涂层处理前后照片及扫描电镜下图像。

图4为本发明的具有免疫调控功能的牙周再生材料的傅里叶红外光谱检测图。

图5为本发明的具有免疫调控功能的牙周再生材料的XPS检测图。

图6为本发明的具有免疫调控功能的牙周再生材料不同巨噬细胞极化诱导因子负载前后溶液剩余因子含量的测试结果示意图。其中A图为ELISA法检测负载IL4前后溶液剩余因子含量；B图为ELISA法检测负载IFNγ前后溶液剩余因子含量；C图为LPS试剂盒检测负载LPS前后溶液剩余因子含量。

图7为本发明的具有免疫调控功能的牙周再生材料植入牙周缺损3天后缺损区域局部免疫相关基因的表达示意图。

图8为本发明的具有免疫调控功能的牙周再生材料植入牙周缺损4周后组织石蜡切片H&E染色后的扫描电镜图。

具体实施方式

如下结合附图，对本申请方案作进一步描述：

实施例1

一种具有免疫调控功能的牙周再生材料，包括适配牙周缺损的生物源性钙磷灰石颗粒和巨噬细胞极化诱导因子，所述巨噬细胞极化诱导因子负载于所述生物源性钙磷灰石颗粒上。具体的，所述适配牙周缺损的生物源性钙磷灰石颗粒上覆盖有聚多巴胺涂层，所述巨噬细胞极化诱导因子负载在聚多巴胺涂层上。所述适配牙周缺损的生物源性钙磷灰石颗粒来源于动物骨，优选猪骨。本实施例的巨噬细胞极化诱导因子选用IL4。

一种上述的具有免疫调控功能的牙周再生材料的制备方法，包括以下步骤：

S1、适配牙周缺损的生物源性钙磷灰石颗粒的制备

S1.1、收集土猪双侧股骨干骺端松质骨，电煮锅煮4小时后，用剪刀去尽骨面软组织及软骨；

S1.2、依次使用30%的过氧化氢和无水乙醇各浸泡24小时进行脱脂脱蛋白处理；

S1.3、超纯水漂洗24h后60℃干燥箱干燥备用；

S1.4、采用线性切割系统将骨块切成小块后，将小骨块置于智能管式电阻炉中烧结，升降温速率为10℃/分钟，最高温度800℃下维持2小时，全程空气气氛下烧结，

S1.5、降温后浸泡于超纯水中，置于恒温（37℃）匀速（100 rpm）摇床中漂洗24小时后取出，60℃干燥箱干燥；将干燥后的骨块用研钵研磨，使用不同目数筛网筛选出适配牙周缺损的PHA颗粒，密封保存备用。本实施例采用的粒径范围为0.2-1mm。

S2、巨噬细胞极化诱导因子的负载

S2.1、用精密天平称取称取一定量的Tris碱，加入去离子水，配制成0.01mol/L的Tris碱溶液；

S2.2、用精密天平称取一定量的多巴胺-盐酸盐加入所述的Tris碱溶液，配置成2mg/ml的多巴胺-盐酸盐Tris碱溶液，室温下调节pH值为8.5；

S2.3、将配得溶液滤菌处理后收集备用；

S2.4、往多巴胺-盐酸盐Tris碱溶液中加入准备涂层的生物源性钙磷灰石颗粒，放置在恒温摇床内，温度设置为37℃，转速为60rpm，48h后弃上层清液，去离子水洗涤3次，每次5min，漂洗后离心处理，干燥后即得到聚多巴胺涂层的生物源性钙磷灰石颗粒放在干燥缸内备用；

S2.5、用5%牛血清白蛋白配制500 ng/ml的IL4溶液备用；

S2.6、将聚多巴胺涂层涂覆的生物源性钙磷颗粒放入IL4溶液中浸泡，放置于恒温摇床内，温度设置为4℃，转速为60rpm，24h后取出羟基磷灰石颗粒，转移到-20℃冰箱中保存；

实施例2

本实施例的巨噬细胞极化诱导因子选用LPS和IFNγ，制备方法同实施例1。

将实施例1和2制备的具有免疫调控功能的牙周再生材料进行测试，具体如下：

1. 具有免疫调控功能的牙周再生材料的成功制备

本发明中新型牙周再生材料的研发过程如图1所示，在适配牙周缺损的生物源性钙磷灰石颗粒材料上负载聚多巴胺涂层，再负载不同的巨噬细胞极化诱导因子。

1）适配牙周缺损的生物源性羟基磷灰石材料的制备

通过筛网可以制备不同粒径的生物源性钙磷灰石材料以满足不同大小缺损区域的需求。例如，对于大鼠牙周缺损模型（尺寸：长×宽×高=5×2×1 mm）而言，由图2可见粒径1-2mm和2mm的材料无法很好的适应缺损区域的形状；＜0.2mm的材料可较好的适应缺损区域的形状，但过于紧密，不利于细胞的迁移和生长；0.2-1mm可以较好的适应缺损区域的形状并且留有适当的空隙，利于血液的充盈及细胞的迁移黏附。

2）聚多巴胺涂层的涂覆

如图3所示，生物源性羟基磷灰石材料（PHA）经过聚多巴胺涂层（PDA）处理后颜色由白色变成了黑色，通过扫描电镜观察表面形貌示涂层前后无明显的改变；如图4所示，为材料的傅里叶红外光谱检测，改性后生物源性羟基磷灰石中可观察到多巴胺中特征性碳碳双键吸收峰；如图5所示，为材料的XPS检测结果可见材料含有多巴胺的特征性N元素，这表明聚多巴胺涂层成功构建于生物源性羟基磷灰石材料上。

3）巨噬细胞极化诱导因子的负载

通过ELISA和LPS试剂盒孵育生物源性钙磷灰石材料后溶液中剩余的IL4、IFNγ和LPS的含量，从而得出吸附于其表面的因子含量，如图6所示，测得IL4的负载量约为12.27±0.122 ng/mg，IFNγ的负载量约为4.943 ng/mg, LPS的负载量约为29.18±4.632 Eu/mg。实验结果示以上三种巨噬细胞极化诱导因子通过聚多巴胺涂层均成功负载于生物源性钙磷灰石材料的表面。

2.具有免疫调控功能的牙周再生材料的免疫调控功能

通过检测材料植入牙周缺损3天后局部免疫相关基因的表达，如图7所示，Control组为植入仅有聚多巴胺涂层的生物源性钙磷灰石材料，LPS/IFNγ组为植入负载LPS/IFNγ的材料，IL4组为植入负载IL4的材料，可知植入负载IL4的材料后牙周缺损局部M2型巨噬细胞相关基因表达上调，如TGFβ1、CD163；植入负载LPS/IFNγ的材料局部M1相关基因表达上调，如IFNγ。结果体现了本发明制备的新型牙周材料具备的免疫调控功能。

3.具有免疫调控功能的牙周再生材料植入缺损部位后观察到牙周多组织再生

将负载LPS/IFNγ、IL4的生物源性钙磷灰石材料植入大鼠牙周缺损，4周后取材观察，如图8所示：M所示为植入材料，黑色箭头所指为新生的牙骨质，星号所示为增宽新生的牙周膜纤维，NB所示为新生的牙槽骨组织，我们发现植入负载IL4的材料在局部观察到了牙槽骨-牙周膜-牙骨质的再生，而在其余两组仅观察到纤维和少量新骨的再生（Control组为植入仅有聚多巴胺涂层的材料），提示我们负载不同的巨噬细胞极化诱导因子在牙周缺损局部会产生不同的效应，利于再生修复的巨噬细胞极化诱导因子的负载可实现良好的牙周多组织再生。

上述优选实施方式应视为本申请方案实施方式的举例说明，凡与本申请方案雷同、近似或以此为基础作出的技术推演、替换、改进等，均应视为本专利的保护范围。