脱落酸在促进人诱导多能干细胞体外分化为巨核细胞和血小板中的用途

摘要

本发明涉及医药技术领域，提供了脱落酸在制备人诱导多能干细胞体外分化为巨核细胞和血小板促进剂中的用途，在该促进剂中，脱落酸的最优浓度为10μmol/L。此外，本发明还提供了一种提高人诱导多能干细胞体外巨核分化效率的方法，在人诱导多能干细胞诱导分化巨核细胞的过程中，至少在第0～14天添加脱落酸进行刺激，通过实验验证，ABA促进人iPSC源性MK的生成和成熟；人类iPSCs分化培养在0‑14天的ABA刺激可促进巨核细胞的产生数量增加，并且仅在第14‑19天进行ABA刺激，不会促进MK数量增加和分化；在第19天，人类iPSCs分化培养ABA的0‑14天持续刺激对MK分化的促进效果等同于人类iPSCs分化培养0‑19天持续刺激的作用。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及脱落酸在促进人诱导多能干细胞体外分化为巨核细胞和血小板中的用途，还涉及一种提高人诱导多能干细胞体外巨核分化效率的方法。

背景技术

血小板输注是大手术术后及放化疗后患者重要的支持治疗，是血小板减少或功能障碍所引起出血的不可替代的治疗方法。目前临床治疗所用的血小板只能通过志愿者无偿捐献获得，血源极其紧张，还存在发生输血反应和感染经血传播疾病的风险。因此，血小板临床供应始终处于紧缺状态，尤其对配型困难和产生人白细胞抗原(HLA)或人血小板抗原(HPA)抗体的患者。

诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cells,iPSCs)是通过对体细胞“重编程”培育出的干细胞，可在体外无限扩增培养；人iPSCs体外扩增、诱导分化巨核细胞并产生血小板，可缓解临床血小板供应不足，保障配型困难患者的血小板供应。

虽然很多实验室已经成功报道应用诱导多能干细胞体外诱导分化巨核细胞并生产血小板，但是人iPSCs来源巨核细胞体外生成血小板的效率不及体内过程的1/1000、生成的血小板体内功能下降且价格远远高于捐献血小板。因此，诱导多能干细胞体外巨核分化的方法仍需要进一步改进。

脱落酸(Abscisic acid，ABA)是一种重要的植物激素，可以保护植物免受生物和非生物应急刺激。虽然植物和人类有完全不同的ABA受体，但多项研究表明，ABA在植物和动物中也有一种通用的信号分子。已有研究表明，人粒细胞、间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)和β胰腺细胞可以产生和释放ABA，并发挥细胞特异性效应。在体内模型中，ABA被证明可以通过增加细胞内Ca2

发明内容

本发明依托上述研究进行，对脱落酸对人诱导多能干细胞体外分化为巨核细胞和血小板的促进作用进行探索，第一目的在于脱落酸在制备人诱导多能干细胞体外分化为巨核细胞和血小板促进剂中的用途，第二目的在于提供了一种提高人诱导多能干细胞体外巨核分化效率的方法，提高巨核分化效率以及血小板数量。

正常人血小板由造血干祖细胞(HSPC)定向分化为多能祖细胞(MPP)、髓系祖细胞(CMP)、巨核红系祖细胞(MEP)，经原始巨核细胞(Promegakarycyte)产生巨核细胞(MK)，巨核细胞成熟生成原始血小板(Proplatelet)，最终在血管中脱落形成有功能的血小板。

诱导多能干细胞(iPS)体外诱导生成血小板要经两个阶段调控：①iPS细胞向造血干祖细胞分化；②造血干祖细胞定向分化为巨核细胞和血小板。

脱落酸(AbscisicAcid，ABA)是天然存在的植物激素，是一种安全无毒的物质。脱落酸在哺乳动物中通过第二信使环腺苷酸信号通路刺激先天免疫细胞、间充质干细胞和造血干细胞以及胰岛素释放的胰腺β细胞的活性。微摩尔量的脱落酸被证明可以增殖未分化的人类造血祖细胞。

本发明首次证明了脱落酸在人诱导多能干细胞体外巨核分化中的作用，脱落酸是体外诱导人多能干细胞巨核细胞分化的增殖因子。

应用脱落酸可以增加人诱导多能干细胞体外分化为CD34

发明人发现人iPSCs体外分化培养中，ABA处理促进第14天造血祖细胞(CD34

在血小板衍生过程中，脱落酸处理不仅在第14天促进了CD41

本发明第一方面，提供了脱落酸在制备人诱导多能干细胞体外分化为巨核细胞和血小板促进剂中的用途。

优选的，该促进剂中，脱落酸的浓度为10～25μmol/L，最优浓度为10μmol/L。在分化培养基中加入不同浓度的ABA，然后在第14天用流式细胞术检测CD34

本发明的第二方面，提供了一种提高人诱导多能干细胞体外巨核分化效率的方法：在人诱导多能干细胞诱导分化巨核细胞的过程中，至少在第0～14天添加脱落酸进行刺激。

优选的，所述脱落酸的浓度为10μmol/L。在诱导分化过程中，仅在第0～14天添加脱落酸进行刺激。

通过实验验证，ABA能够促使MK分化阶段提前，但仅在第14-19天的ABA刺激不能促进MK分化；ABA的第0-14天刺激促进iPSCs向MK分化，其促进效果等同于第0-19刺激的作用；同时，ABA刺激可促进巨核细胞分化成熟，但其作用效果优于0-19天的ABA持续刺激。

进一步，提高人诱导多能干细胞体外巨核分化效率的方法包括如下具体步骤：

(1)第-3天：将人诱导多能干细胞以5-10×10

(2)第0天：细胞长满＞70％后，将细胞消化成单细胞；按照3000-4000个细胞/孔、每孔中添加50μL无血清培养基的方式将溶液加入U型底96孔板中，随后1500rpm，5min离心，置于37℃、5％CO

(3)第2天：按照50μL/孔加液补充无血清培养基，所述无血清培养基中含10ng/mLBMP4、10ng/mLbFGF、20ng/mLVEGF、50ng/mL SCF以及10μmol/L脱落酸；

(4)第5天：按照50μL/孔加液补充无血清培养基，所述无血清培养基中含10ng/mLBMP4、10ng/mLbFGF、10ng/mLVEGF、50ng/mL SCF以及10μmol/L脱落酸；

(5)第8天：每孔弃100μL液体，后加液补充50μL无血清培养基/孔，所述无血清培养基中含10ng/mLBMP4、10ng/mLbFGF、10ng/mLVEGF、50ng/mL SCF以及10μmol/L脱落酸；

(6)第11天：加液补充50μL无血清培养基/孔，所述无血清培养基中含10ng/mLBMP4、10ng/mLbFGF、10ng/mLVEGF、50ng/mL SCF、60ng/mL TPO以及10μmol/L脱落酸，TPO的终浓度为20ng/ml；

(7)第14天：收集EB细胞分泌的造血细胞，将细胞转移至6孔板中培养，培养液为2mL无血清培养基/孔，继续培养5天；所述无血清培养基含20ng/mL SCF、10ng/ml IL 11、50ng/mL TPO以及10μmol/L脱落酸；

(8)第19天：收集巨核细胞。

进一步，所述提高人诱导多能干细胞体外巨核分化效率的方法，还包括人诱导多能干细胞细胞复苏以及传代培养的步骤，

细胞复苏过程包括如下步骤：(1)将细胞培养液置于37℃水浴锅中预热；(2)将细胞冻存管从液氮或-80℃冰箱中取出后立即于37℃水浴锅中摇晃冻存管，使细胞快速解冻，至液体中尚余小冰块时迅速取出，转移至超净台中，加入1mL培养液混匀后，1500rpm，5min离心；(3)弃去上清，向冻存管中加入预热的培养液，重悬细胞，计数后种至6孔板中，十字法使细胞混合均匀；(4)将6孔板放置于37℃，5％CO

传代培养过程包括如下步骤：(1)准备matrigel铺板的六孔板；(2)将赛贝培养液置于37℃水浴锅中预热；(3)将细胞培养板从培养箱中取出，显微镜下观察其生长状态及密度，细胞克隆密度达70％～80％可传代；(4)将人诱导多能干细胞培养皿置于超净台中，用无菌移液枪弃去上清，取1mLPBS，至培养皿中将细胞洗涤一次，弃去PBS；(5)取1mL0.05mMEDTA加入培养皿中，轻轻震荡，使其充分平铺于细胞表面，镜下观察细胞克隆边缘卷起，细胞已经变圆，用移液枪吸去EDTA，用移液枪加入2ml赛贝培养液，轻轻吹下培养皿底部的细胞，根据细胞克隆密度，以不同的密度传代至铺Matrigel的6孔板中；(6)24h后观察细胞密度，待细胞克隆密度至70％～80％时进行下一次传代。

发明的作用与效果

通过实验验证，ABA促进人iPSC源性MK的生成和成熟；人类iPSCs分化培养在0-14天的ABA刺激可促进巨核细胞的分化阶段提前，并且仅在第14-19天进行ABA刺激，不会促进MK分化；在第19天，人类iPSCs分化培养ABA的0-14天持续刺激对MK分化的促进效果等同于人类iPSCs分化培养0-19天持续刺激的作用。

机理方面，在存在ABA的情况下，第8天的ERK1/2和AKT信号转导无显着差异，但参与MK分化的AKT和ERK1/2的磷酸化在14天时相对于ABA未处理组显著增加，表明在持续14天ABA刺激的情况下，相对未处理组，ERK1/2和AKT信号信号转导途径的激活水平增强。

因此，脱落酸在促进人诱导多能干细胞体外分化为巨核细胞和血小板方面存在巨大潜力，本发明也为体外获取血小板提供了一种新的途径。

附图说明

图1为不同脱落酸浓度对iPSCs体外分化的影响，A.不同培养时间阶段产生的CD

图2为分化第19天细胞数检测，A为ABA处理组和非处理组细胞总数对比(P<0.05)；B为第19天时，ABA处理组和非处理组普通显微镜下观察对比。

图3是第19天，MK流式检测结果：A.第19天，ABA处理组流式分析典型图；B-D.ABA未处理组和处理组在第19天的相对CD

图4为巨核细胞形态及DNA倍性检测：A.Wright-Giemsa染色的代表性图像。BM来源MK(左)；hiPSC来源MK(右)；比例尺＝25μm；B.第19天，激光共聚焦显微镜检测hiPSC-MKs表面分子vWF、CD42b分子及β-tubulin的表达情况。将细胞用针对VWF(红色)，针对CD42b(绿色)，针对DAPI(蓝色)的抗体染色(比例尺＝25μm)；C.第19天，ABA处理组和未处理组中hiPSC-MKs DNA倍性的代表性数据(**P<0.01；*P<0.05)。

图5为血小板形态学观察：A.普通光学显微镜下前血小板形成典型图(比例尺＝50μm)；B.第19天，ABA非处理组与处理组产生MK-PLTs数量比较(光学显微镜下计数；**P<0.01)。

图6为第8天的细胞计数比较：ABA处理和未处理组中CD

图7为第14天的细胞数检测：A.第14天，ABA处理组和非处理组中从hiPSC-EB释放出的细胞总数(P<0.01)；B-D.在第14天，ABA处理和未处理组中的相对CD

图8.为第14天，细胞染色观察：A.Wright-Giemsa染色的代表性HPC图像(比例尺＝10μm)；B.第14天，ABA处理组与非处理组激光共聚焦显微镜检测hiPSC-HPCs表面分子CD34、CD456的表达情况。将细胞用针对CD34(绿色)，针对CD45(红色)，针对DAPI(蓝色)的抗体染色(比例尺＝25μm)。

图9为收集第14天的细胞，进行集落形成实验：A.第14天，ABA处理组和非处理组CFC的计数结果比较(**P<0.01；*P<0.05)；B.不同CFU的代表性图像(比例尺＝25μm)。

图10为第19天，非ABA处理组和ABA(d14-19)处理组的总细胞数(P＞0.05)比较。

图11为第19天时的MK检测：A-C.未经处理及ABA(d14-19)处理组中CD

图12为第19天，非ABA处理组与ABA(d0-14)处理组和ABA(d0-19)处理组总细胞数比较(**P<0.01；*P<0.05)。

图13为第19天，MK流式分析：A-C.第19天，未处理组、ABA(d0-14)和ABA(d0-19)处理组CD

图14蛋白印迹分析及流式细胞分析：A.s的产生过程中，通过蛋白质印迹法测定CD

图15为在0～14天刺激时，ABA对参与MK分化的AKT和ERK1/2的磷酸化的促进作用。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。

一、实验方法

(一)细胞复苏

1.准备冰盒，37℃水浴锅；

2.将细胞培养液置于37℃水浴锅中预热；

3.从液氮或-80℃冰箱中去除细胞冻存管，置于冰上；

4.取冻存管立即于37℃水浴锅中摇晃冻存管，使细胞快速解冻，至液体中尚余小冰块时迅速取出，转移至超净台中，加入1mL培养液混匀后，1500rpm，5min离心；

5.弃去上清，向冻存管中加入预热的培养液，重悬细胞，计数后种至6孔板中，十字法使细胞混合均匀；

6.将6孔板放置于37℃，5％CO

(二)CBiPS细胞的培养与传代

1.将移液枪、15mL离心管、6孔细胞培养板放置于超净台中，紫外消毒30min；

2.准备37℃水浴锅；

3.准备matrigel铺板的六孔板；

4.将赛贝培养液置于37℃水浴锅中预热；

5.将CBiPS细胞培养板从培养箱中取出，显微镜下观察其生长状态及密度，细胞克隆密度达70％～80％可传代；

6.将CBiPS细胞培养皿置于超净台中，用无菌移液枪弃去上清，取1mLPBS，至培养皿中将细胞洗涤一次，弃去PBS；

7.取1mL 0.05mM EDTA加入培养皿中，轻轻震荡，使其充分平铺于细胞表面，镜下观察CBiPS细胞克隆边缘卷起，细胞已经变圆，用移液枪吸去EDTA，用移液枪加入2ml赛贝培养液，轻轻吹下培养皿底部的细胞，根据细胞克隆密度，以不同的密度传代至铺Matrigel的6孔板中；

8.24h后观察细胞密度，待细胞克隆密度至70％～80％时进行下一次传代。

(三)hiPSCs Spin-EB法培养诱导分化巨核细胞

1.第-3天：按照5-10×10

2.第0天：细胞长满＞70％后，用Accutase将iPS细胞消化成单细胞，按照3000-4000个细胞/孔、50μL/孔serum free media(SFM)将溶液加入U型底96孔板中，随后1500rpm，5min离心，置于37℃,5％CO2孵箱中培养；SFM培养基中含BMP4(10ng/ml)、bFGF(10ng/ml)及ROCK抑制剂(Y27632,10μM)，同时补充。

3.第2天：加液补充50μLSFM/孔，SFM含BMP4(10ng/ml)、bFGF(10ng/ml)、VEGF(20ng/ml)和SCF(100ng/ml)；细胞因子终浓度：BMP4(10ng/ml),bFGF(10ng/ml)、VEGF(10ng/ml)and SCF(50ng/ml)。

4.第5天：加液补充50μLSFM/孔，SFM含BMP4(10ng/ml)、bFGF(10ng/ml)、VEGF(10ng/ml)和SCF(50ng/ml)；

5.第8天：每孔弃100μL液体，后加液补充50μLSFM/孔SFM，SFM含BMP4(10ng/ml)、bFGF(10ng/ml)、VEGF(10ng/ml)和SCF(50ng/ml)；

6.第11天：加液补充50μLSFM/孔SFM，SFM含BMP4(10ng/ml)、bFGF(10ng/ml)、VEGF(10ng/ml)、SCF(50ng/ml)及TPO(60ng/ml)，TPO的终浓度为20ng/ml；

7.第14天：收集EB细胞分泌的造血细胞(CD34

每次补液时，同时补充10μMABA，第19天时收集巨核细胞(CD41

(四)巨核细胞形态观察

普通光学显微镜观察ABA处理组和非处理组hiPSCs诱导分化的巨核细胞，比较细胞形态及数量。

(五)巨核细胞多倍性检测

收集培养19天的悬浮细胞，离心洗涤后用25μg/ml Hoechst 33342(Sigma-Aldrich)37℃孵育45分钟，再标记抗人CD41a-APC and CD42b-FITC 30分钟，预冷PBS洗涤后，加入PI进行流式分析。

(六)流式检测

在第14天和第19天，将收获的单细胞标记为抗人CD34-PE(Invitrogen，www.thermofisher.com)，CD45-APC-cy7(Invitrogen)，CD41-APC(eBioscience，http：//www(ebioscience.com)，CD42a-efluor 450(eBioscience)，CD42b-FITC(eBioscience)。通过FACS Calibur流式细胞仪(BD Biosciences)分析所有样品。

(七)MK形态分析

分化19天后，使用Wright-Giemsa对单个细胞进行染色以进行细胞形态分析。

(八)共聚焦显微镜分析

1.收集培养19天的细胞，运用细胞涂片机涂片；

2.4％多聚甲醛，固定20min(避光)，随后用PBS洗3次(5min/次)；

3.TritonX-100(0.3％～0.5％)，通透20min(避光)，PBS洗3次(5min/次)；

4.5％BSA封闭1h；

5.一抗：配置150μl抗vWF抗体(1:200)，每张涂片50μl，4℃过夜孵育；

6.倾倒弃去一抗，PBS洗3次(5min/次)；

7.二抗：594抗体(1:200)；CD42b-FITC(1:200)室温孵育1.5-2h，倾倒弃去抗体，PBS洗3次(5min/次)；

8.DAPI：1:300孵育5min，PBS洗3次(5min/次)；

9.晾干玻片，后滴加封片剂，加盖玻片封闭玻片，轻轻排出气泡；

10.共聚焦显微镜观察。

二、结果分析

1、第0-19天应用ABA促进人iPSCs体外分化，MKs的生成和成熟

1.1ABA处理最佳浓度的选择

我们在无饲养层和无血清的条件下，基于spin-EB分化系统进行了造血分化。收集了第14天EB释放的CD34

为了检测ABA的作用，我们先在分化培养基中加入不同浓度的ABA(0μM、1μM、2.5μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM)，然后在第14天用流式细胞术检测CD34

1.2ABA处理促进了hiPSC分化出的细胞增殖

对第19天收集的细胞进行计数，结果如图2显示，ABA处理组在第19天获得的总细胞数增加(图2A；P<0.05)。同时使用光学显微镜对第19天ABA处理组和非处理组的细胞进行观察，相同放大倍数下，ABA处理组细胞数量明显多于非处理组(图2B)。

1.3第19天，ABA处理促进巨核细胞的分化及成熟

此外，我们在第19天进行了流式细胞术以确定细胞特征(图3A)。根据流式细胞仪分析，在用ABA处理的情况下，CD41

1.4形态学和染色体倍性分析证实ABA促进巨核细胞成熟

在第19天，对巨核细胞的形态以及染色体倍性进行分析：图4A显示了Wright-Giemsa染色的代表性图像，左方为骨髓来源巨核细胞，右方为hiPSC来源巨核细胞(比例尺＝25μm)；图4B显示了第19天，源自hiPSC的MK中vWF、CD42b的免疫荧光表达。将细胞用针对VWF(红色)，针对CD42b(绿色)，针对DAPI(蓝色)的抗体染色(比例尺＝25μm)。

第19天，ABA处理组中hiPSC-MKs DNA倍性明显高于未处理组(图4C)，细胞形态也明显偏向于成熟巨核细胞。

1.5第19天，可镜下可观察到血小板

ABA处理组和非处理组均可在镜下观察到前血小板和血小板的形成(图5A)。第19天，显微镜下观察和计数培养上清液中形成血小板前体或芽生血小板的MKs(MK-PLTs)数量，ABA处理组的MK-PLT数量高于未处理组，差异有统计学意义(图5；P<0.01)。

2、第0-14天的ABA刺激可促进CD41

为进一步研究在ABA在人类iPSCs巨核细胞分化过程中哪个阶段起作用。我们在人类iPSCs分化培养的第14天分化时收集EB释放的未成熟的造血细胞进行分析。结果显示，0-14天ABA刺激可促进CD41

2.1ABA刺激能够促进HSC生成

首先，在分化第8天流式细胞仪检测两组细胞CD34、CD45的表达，结果显示，发现ABA处理组CD34

2.2第14天流式细胞分析表明ABA能够促使MK分化阶段提前

第14天，收集EB释放的细胞，计数结果显示，ABA处理组总细胞数明显高于非处理组，差异有统计学意义(图7A)。HPC的细胞表面标志物是CD34

2.3第14天Wright-Giemsa染色可观察到早期造血细胞

第14天，收集悬浮细胞进行Wright-Giemsa染色，可在镜下观察到早期造血细胞图像，如图8A所示。通过激光共聚焦免疫荧光染色，也可观察到ABA处理和未处理组HPC相关细胞表面分子CD34和CD45的表达(图8B)。

2.4集落形成试验

收集14天生成的细胞进行集落形成实验，研究ABA促进集落形成的能力。结果表明，ABA诱导的CFU-M/MK和CFU-GM集落形成均高于对照组(分别为P<0.01，P<0.05)。结果表明，0-14d的ABA持续刺激可促进HPC向MK分化。(图9A、B)

这些结果表明，0-14天ABA刺激可以促进HPC提前向MK细胞分化。

3、仅在第14-19天的ABA刺激不能促进MK分化

为进一步验证ABA的刺激是否促进MK的成熟，我们仅在人类iPSCs分化培养的第14-19天用10μMABA处理。

3.1 14-19天ABA刺激不能促进19天时总细胞增殖

我们首先比较了ABA处理组和非处理组在第19天时的细胞计数，结果如图10显示，两组之间无显着差异(P＝0.3446)。

3.2 14-19天ABA刺激不能促进巨核细胞分化

收集第19天的细胞，进行CD41

4、ABA的D0-14天刺激也促进MK分化，在第19天，其促进效果等同于D0-19刺激的作用

到目前为止，我们还没有发现ABA处理的哪一阶段更能促进MK增殖。我们前面的研究提示0到14天的ABA刺激可能会更有效的促进19天时MK细胞的增殖。为了证明这一点，我们仅在0-14天添加ABA，在14天至19天停止添加ABA，在19天的时候进行统计分析。

4.1 0-14天ABA刺激可促进19天时总细胞增殖

第19天，我们首先计数ABA(0-14)处理组和非处理组的总细胞数，并进行比较。结果显示：ABA处理组的总细胞数显着高于ABA非处理组(图12；P<0.01)；同时，ABA(d0-14)处理组与ABA(d0-19)处理组细胞总数在第19天无统计学差异(图12)。

4.2 0-14天ABA刺激可促进巨核细胞分化成熟

第19天，流式分析结果显示：与未处理组相比，ABA(d0-14)处理组CD41

第19天，显微镜下观察和计数培养上清液中的MK-PLTs，ABA(d0-14)处理组产生MK-PLTs数量与对照组相比明显升高，差异有统计学意义(图13D；P<0.01)，与ABA(d0-19)处理组产生MK-PLTs数量无明显差异(图13D)。

进一步分析第19天未处理组、ABA(d0-14)处理组、ABA(d14-19)处理组和ABA(d0-19)处理组中每个HPC产生的MK数量，并进行比较，结果显示，各组间产生的CD41

4.3 14天时，ABA刺激作用后，ERK1/2和AKT信号信号转导途径的激活水平增强

为进一步研究ABA的作用机制，我们通过蛋白质印迹法测定CD34

在分化第0-14天，用0μM、2.5μM、5μM和10μM PKA抑制剂(H89)刺激，用或不用10μMABA，第19天研究结果发现总细胞数和CD41

综上所述，ABA可促进CD34

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。