溶瘤病毒在葡萄膜黑色素瘤治疗上的应用、治疗效果的标记物及其检测试剂

摘要

本发明公开了一种用于治疗、预防和/或减缓葡萄膜黑色素瘤的制剂，该制剂包括能够表达胞嘧啶脱氨酶基因的溶瘤性1型单纯疱疹病毒以及5‑氟胞嘧啶，二者联用能够显著地减少葡萄膜黑色素瘤体积并改善受试者生存期。本发明还公开了一种用于评价葡萄膜黑色素瘤通过前述制剂治疗效果的标记物，该标记物选自能够表征上皮间质转化程度的标记物，主要包括IL‑6、DPD、TWIST1、ZEB1、CD44和CDH1。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种用于评价葡萄膜黑色素瘤治疗效果的标记物及其检测制剂，特别涉及用于评价含有胞嘧啶脱氨酶基因的溶瘤性单纯疱疹病毒联合5-FC治疗葡萄膜黑色素瘤的治疗效果的标记物及其检测制剂以及相应的包含该标记物或检测制剂的试剂盒。

背景技术

溶瘤病毒作为一种新兴的、重要的肿瘤治疗方法，可以选择性的对肿瘤细胞进行杀伤和破坏。可选择性复制并引起肿瘤细胞直接裂解的多种溶瘤性RNA和DNA病毒已被广泛报道

葡萄膜黑色素瘤(UM)是成年人中最常见的原发性眼内恶性肿瘤

参考文献：

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发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明第一方面提供了一种用于评价葡萄膜黑色素瘤治疗效果的标记物，所述治疗为向所述葡萄膜黑色素瘤个体的瘤细胞或瘤组织、体外葡萄膜黑色素瘤组织、或体外葡萄膜黑色素瘤细胞施用溶瘤性单纯疱疹病毒，所述标记物选自能够表征上皮间质转化程度的标记物。

在一些实施方式中，所述溶瘤性单纯疱疹病毒为溶瘤性1型单纯疱疹病毒。

在一些实施方式中，所述体外葡萄膜黑色素瘤细胞选自MUM2B细胞系，92.1细胞系和MP41细胞系。

在一些实施方式中，所述葡萄膜黑色素瘤个体为异种移植肿瘤动物，或者患有葡萄膜黑色素瘤的人或动物。

在一些实施方式中，所述异种移植肿瘤动物为将人葡萄膜黑色素瘤细胞移植到小鼠体内形成的异种移植肿瘤动物。

在一些实施方式中，在所述治疗中，向所述葡萄膜黑色素瘤个体的瘤细胞或瘤组织、所述体外葡萄膜黑色素瘤组织、或所述体外葡萄膜黑色素瘤细胞施用肿瘤化疗药物前体5-氟胞嘧啶。

在一些实施方式中，所述溶瘤性单纯疱疹病毒含有能够将肿瘤化疗药物前体5-氟胞嘧啶转化为肿瘤化疗药物的编码胞嘧啶脱氨酶的基因。

在一些实施方式中，所述溶瘤性单纯疱疹病毒是γ

在一些实施方式中，所述编码胞嘧啶脱氨酶的基因为大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因。

在一些实施方式中，所述胞嘧啶脱氨酶基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

在一些实施方式中，所述胞嘧啶脱氨酶基因的核酸序列如SEQ ID NO.13所示。

在一些实施方式中，所述标记物为IL-6信号传导途径的标记物、STAT3信号传导途径的标记物和/或TGF beta信号传导途径的标记物。

在一些实施方式中，所述标记物选自：DPD、TWIST1、ZEB1、CD44、CDH1、IL-6、TS、p-STAT3、CDH2、波形蛋白中的任1-10种。

使用本发明的标记物来评价葡萄膜黑色素瘤治疗效果的方法包括：采用溶瘤性单纯疱疹病毒或该病毒与5-氟胞嘧啶连用治疗前，检测被治疗对象血浆或原发肿瘤病理组织中IL-6、DPD、TWIST1、ZEB1、CD44、TS、p-STAT3、波形蛋白CDH1和TS中任意一种或多种的浓度，经过治疗后再次检测血浆或原发肿瘤病理组织中上述物质中一种或多种的浓度或表达量，如果IL-6、DPD、TWIST1、ZEB1、CD44、TS、p-STAT3和波形蛋白中任1-7种浓度或表达量显著下降，和/或CDH1和/或TS浓度或表达量显著增加，则证明溶瘤性单纯疱疹病毒或该病毒与5-氟胞嘧啶连用的治疗效果显著。

本发明第二方面提供了一种用于检测本发明第一方面所述标记物的试剂，所述试剂为用于检测所述标记物的mRNA表达量的试剂和/或用于检测所述标记物的蛋白表达量的试剂。

在一些实施方式中，用于检测所述标记物的mRNA表达量的试剂包括使用定量PCR方法检测所述标记物表达量的试剂，使用基因芯片方法检测所述标记物表达量的试剂，或者使用高通量测序方法检测所述标记物表达量的试剂。

在一些实施方式中，所述使用定量PCR方法检测所述标记物表达量的试剂包括检测所述标记物的定量PCR引物对。

在一些实施方式中，检测所述标记物的定量PCR引物对选自检测DPD的定量PCR引物对、检测TWIST1的定量PCR引物对、检测ZEB1的定量PCR引物对、检测CD44的定量PCR引物对、检测CDH1的定量PCR引物对、检测IL-6的定量PCR引物对、检测TS的定量PCR引物对、检测p-STAT3的定量PCR引物对、检测CDH2的定量PCR引物对、检测波形蛋白的定量PCR引物对中的任1-10对。

在一些实施方式中，所述检测DPD的定量PCR引物对的特异性序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

所述检测TWIST1的定量PCR引物对的特异性序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

所述检测ZEB1的定量PCR引物对的特异性序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

所述检测CD44的定量PCR引物对的特异性序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；和/或

所述检测CDH1的定量PCR引物对的特异性序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

在一些实施方式中，所述用于检测所述标记物的mRNA表达量的试剂还包括使用定量PCR方法检测内参基因表达量的试剂。

在一些实施方式中，所述内参基因选自GAPDH、β-Actin或其组合。

在一些实施方式中，所述检测内参基因表达量的试剂包括检测所述内参基因的定量PCR引物对。

在一些实施方式中，检测所述内参基因的定量PCR引物对的特异性序列如SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12所示。

在一些实施方式中，所述用于检测所述标记物的蛋白表达量的试剂包括使用蛋白印迹方法检测所述标记物表达量的试剂，使用ELISA方法检测所述标记物表达量的试剂，或者使用质谱方法检测所述标记物表达量的试剂。

在一些实施方式中，所述使用蛋白印迹方法检测所述标记物表达量的试剂或所述使用ELISA方法检测所述标记物表达量的试剂选自检测DPD的抗体、检测TWIST1的抗体、检测ZEB1的抗体、检测CD44的抗体、检测CDH1的抗体、检测IL-6的抗体、检测TS的抗体、检测p-STAT3的抗体检测CDH2的抗体、检测的波形蛋白的抗体中的任1-10种。

在一些实施方式中，使用蛋白印迹方法检测所述标记物表达量的试剂或使用ELISA方法检测所述标记物表达量的试剂选自检测DPD的单克隆抗体、检测TWIST1的单克隆抗体、检测ZEB1的单克隆抗体、检测CD44的单克隆抗体、检测CDH1的单克隆抗体、检测IL-6的单克隆抗体、检测TS的单克隆抗体、检测p-STAT3的单克隆抗体、检测CDH2的单克隆抗体、检测波形蛋白的单克隆抗体中的任1-10种。

在一些实施方式中，用于检测所述标记物的蛋白表达量的试剂还包括使用蛋白印迹方法或使用ELISA方法检测内参基因表达量的试剂。

在一些实施方式中，所述内参基因选自GAPDH、β-Actin或其组合。

在一些实施方式中，所述检测内参基因表达量的试剂为检测所述内参基因的抗体。

在一些实施方式中，所述检测内参基因表达量的试剂为检测所述内参基因的单克隆抗体。

本发明第三方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括本发明第二方面所述的试剂。

本发明第四方面提供了一种用于治疗、预防和/或减缓葡萄膜黑色素瘤的制剂，所述制剂包括重组溶瘤性单纯疱疹病毒和肿瘤化疗药物前体，所述重组溶瘤病毒包括具备表达活性的前药转化基因，所述前药转化基因的表达产物用于将所述肿瘤化疗药物前体转化为肿瘤化疗药物。

在一些实施方式中，所述前药转化基因为胞嘧啶脱氨酶基因，所述肿瘤化疗药物前体为5-氟胞嘧啶。

在一些实施方式中，所述胞嘧啶脱氨酶基因为大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因。

在一些实施方式中，所述胞嘧啶脱氨酶基因所编码蛋白质的氨基酸序列为SEQ IDNO.14。

在一些实施方式中，编码所述胞嘧啶脱氨酶的基因的核酸序列为SEQ ID NO.13。

在一些实施方式中，所述重组溶瘤性单纯疱疹病毒是γ

本发明第五方面提供了溶瘤性单纯疱疹病毒在制备治疗IL-6、DPD、TWIST1、ZEB1、CD44、TS、p-STAT3和波形蛋白中任1-7种异常高表达，和/或CDH1和/或TS异常低表达的肿瘤药物方面的应用。

在确定治疗手段前，对肿瘤患者血浆中的IL-6、DPD、TWIST1、ZEB1、CD44、TS、p-STAT3、波形蛋白、CDH1、TS的一种或多种物质浓度或表达量进行检测，如果IL-6、DPD、TWIST1、ZEB1、CD44、TS、p-STAT3、波形蛋白的浓度或表达量明显高于健康人的正常水平，或者CDH1、TS的浓度或表达量明显低于健康人的正常水平，则可以确定该种肿瘤疾病适合采用本发明的溶瘤性单纯疱疹病毒进行治疗。

在本发明第五方面的应用中，作为一种优选实施方式，所述肿瘤包括葡萄膜黑色素瘤。

在本发明第五方面的应用中，作为一种优选实施方式，所述溶瘤性单纯疱疹病毒是γ

本发明第六方面提供了溶瘤性单纯疱疹病毒联用肿瘤化疗药物前体5-氟胞嘧啶在制备治疗IL-6、DPD、TWIST1、ZEB1、CD44、p-STAT3、和波形蛋白中任1-7种异常高表达，和/或CDH1和/或TS异常低表达的肿瘤药物方面的应用。

在一些实施方式中，所述肿瘤包括葡萄膜黑色素瘤；所述溶瘤性单纯疱疹病毒是γ

葡萄膜黑色素瘤(Uveal Melanoma,UM)是最常见的成人原发性眼内恶性肿瘤，并且该肿瘤拥有较高的远处转移率。UM的治疗方法包括眼球摘除、放射性敷贴治疗、局部切除等，研究表明现有疗法在改善患者生存期的作用较小。因此，本发明构建了一个新型溶瘤性1型单纯疱疹病毒(oHSV-1)，含有编码胞嘧啶脱氨酶的自杀基因(Cytosine Deaminase，CD)。本发明检测了编码大肠杆菌CD的oHSV-1的治疗疗效。体外实验提示，oHSV-1-CD与前药5-氟胞嘧啶(5-Fluorocytosine，5-FC)结合可增强溶瘤病毒的治疗功效。体内实验提示，oHSV-1-CD/5-FC治疗UM裸小鼠异种移植动物模型可显著延长其生存期。本发明证明了重建病毒的治疗疗效，并讨论了该治疗方法的潜在分子机制。本发明为进一步探索该溶瘤病毒用于UM临床治疗提供了合理性基础。

本发明构建了一个含有编码大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因CD的oHSV-1，即重组溶瘤性1型单纯疱疹病毒(oHSV-1-CD)，在病毒感染的细胞中，该酶能够将前药5-氟胞嘧啶(5-FC)转化为有细胞毒性的5-氟尿嘧啶(5-FU)，该病毒可选择性地复制并杀死癌细胞。体外和体内实验证明了oHSV-1-CD/5-FC对UM细胞的杀伤功效。本发明中，oHSV-1具有下调IL-6并抑制上皮-间质转化(EMT)表型的能力。同时，实验证明限速酶二氢嘧啶脱氢酶(DPD，DPYD)也被下调。因此，oHSV-1-CD/5-FC的功效协同增强。通过使用细胞杀伤实验和蛋白质印迹测定，透射电子显微镜成像，qPCR，ELISA，免疫荧光染色和IVIS成像的体外和体内实验，本发明为该新型溶瘤病毒联合自杀基因在UM中的作用机理提供了实验证据，验证了疗效并为UM治疗提供新的思路。

葡萄膜黑色素瘤(Uveal Melanoma,UM)是成人最常见的眼内原发性恶性肿瘤。该肿瘤有较高的远处转移率，导致患者死亡率高，与此同时，现有疗法的预后较差。因此，迫切的需要研发用于UM患者的新的治疗方案。本发明构建了一种新型溶瘤性1型单纯疱疹病毒(oHSV-1)，包含编码大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶的基因(Cytosine Deaminase，CD)，研究了其作用机制并评估其在UM裸小鼠异种移植动物模型中的治疗疗效。

oHSV-1载体可有效杀伤人源UM细胞，下调细胞中的IL-6表达，抑制上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)表型。于此同时，病毒感染UM细胞可以下调限速酶二氢嘧啶脱氢酶(Dihydropyrimidine Dehydrogenase，DPD)。将CD基因引入病毒骨架不会改变病毒的溶瘤特性，从而增强了oHSV-1-CD/5-FC在体内外的治疗效果。溶瘤病毒治疗裸小鼠原位肿瘤种植模型可减少肿瘤体积并改善小鼠生存期。

oHSV-1-CD/5-FC可有效治疗UM，诱导持久的抗肿瘤反应，CD表达将5-FC转化为5-FU。DPD的下调减少了5-FU代谢，增强了病毒的细胞杀伤作用，而溶瘤病毒下调IL-6以逆转EMT表型。

附图说明

图1为oHSV-1-CD的构建示意图。

图2示出了人葡萄膜黑色素瘤细胞系对溶瘤性HSV-1载体敏感性测试结果。

图3示出了溶瘤性HSV-1载体导致DPD的下调并抑制EMT表型的照片。

图4示出了溶瘤病毒oHSV-1-CD/5-FC对UM细胞系治疗效果。

图5示出了oHSV-CD/5-FC通过下调IL-6抑制EMT，并在体外下调DPD情况。

图6示出了oHSV-CD/5-FC在BALB/c裸小鼠异种肿瘤移植模型中诱导抗肿瘤功效。

图7示出了溶瘤病毒在体内下调IL-6信号传导并抑制DPD表达。

图8示出了5-FU对人葡萄膜黑色素瘤细胞株显示较小的敏感性。

图9示出了IL-6和DPD在葡萄膜黑色素瘤患者的肿瘤标本中表达良好(n＝9)。

图10示出了UM样品中DPD的表达与IL-6和STAT3正相关(n＝79)。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

一、材料和方法

1.细胞系

在本发明中使用了MUM2B(基因型为BRAF野生型)，92.1(基因型为GNAQ突变型)和MP41(基因型为GNA11突变型)细胞系。原始MUM2B和原始MP41细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD，USA)，在含10vol％胎牛血清的DMEM培养基中培养。原始92.1细胞系是马萨诸塞州总医院的Vavvas Demetrios教授和Efstathiou Nikolaos博士赠予。将92.1细胞在含10vol％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。用CMV/萤火虫-荧光素酶-新霉素慢病毒(Genechem,Shanghai,China，载体编号为：GV542，元件顺序为：Ubi-MCS-firefly_Luciferase-SV40-neomycin)转染所有细胞系，转染的剂量MOI＝10，以便后续体内、外实验，进行IVIS成像观察，转染不影响oHSV-1的感染能力与生物活性，本发明后续步骤所用的MUM2B，92.1和MP41细胞系都是转染后的细胞系。

2.溶瘤病毒

在本发明中，对所述溶瘤单纯疱疹病毒的种类没有特别的限定，可以为本领域的任何已知的溶瘤单纯疱疹病毒，但是为了更好地实现外源核酸的稳定表达以及对肿瘤细胞的杀伤目的，所述单纯疱疹病毒优选为I型单纯疱疹病毒。本发明所述单纯疱疹病毒的来源也没有特别的限定，可以通过常规的商购获得，也可以通过实验室自行分离获得，优选为人源单纯疱疹病毒。本发明所用的溶瘤性1型单纯疱疹病毒在未特别限定时可以为野生型溶瘤性1型单纯疱疹病毒也可以为重组溶瘤性1型单纯疱疹病毒。重组溶瘤性1型单纯疱疹病毒是对野生型溶瘤性1型单纯疱疹病毒(HSV-1)改造后获得，其构建方法如下：

按照申请号2004100064921的专利申请中记载的方法将野生型HSV-1病毒(其基因序列的GenBank号：NC_001806，下同)的ICP34.5基因和ICP47基因敲除以产生溶瘤性HSV-1载体(oHSV-1)，然后在敲除ICP34.5基因的位置插入包含大肠杆菌CD基因的外源核酸序列(参见图1)。图1为插入了大肠杆菌CD转基因(核酸序列参见SEQ ID NO.13，蛋白序列参见SEQ ID NO.14)的示意图，替代了γ

SEQ ID NO.13序列：

ATGTCGAATAACGCTTTACAAACAATTATTAACGCCCGGTTACCAGGCGAAGAGGGGCTGTGGCAGATTCATCTGCAGGACGGAAAAATCAGCGCCATTGATGCGCAATCCGGCGTGATGCCCATAACTGAAAACAGCCTGGATGCCGAACAAGGTTTAGTTATACCGCCGTTTGTGGAGCCACATATTCACCTGGACACCACGCAAACCGCCGGACAACCGAACTGGAATCAGTCCGGCACGCTGTTTGAAGGCATTGAACGCTGGGCCGAGCGCAAAGCGTTATTAACCCATGACGATGTGAAACAACGCGCATGGCAAACGCTGAAATGGCAGATTGCCAACGGCATTCAGCATGTGCGTACCCATGTCGATGTTTCGGATGCAACGCTAACTGCGCTGAAAGCAATGCTGGAAGTGAAGCAGGAAGTCGCGCCGTGGATTGATCTGCAAATCGTCGCCTTCCCTCAGGAAGGGATTTTGTCGTATCCCAACGGTGAAGCGTTGCTGGAAGAGGCGTTACGCTTAGGGGCAGATGTAGTGGGGGCGATTCCGCATTTTGAATTTACCCGTGAATACGGCGTGGAGTCGCTGCATAAAACCTTCGCCCTGGCGCAAAAATACGACCGTCTCATCGACGTTCACTGTGATGAGATCGATGACGAGCAGTCGCGCTTTGTCGAAACCGTTGCTGCCCTGGCGCACCATGAAGGCATGGGCGCGCGAGTCACCGCCAGCCACACCACGGCAATGCACTCCTATAACGGGGCGTATACCTCACGCCTGTTCCGCTTGCTGAAAATGTCCGGTATTAACTTTGTCGCCAACCCGCTGGTCAATATTCATCTGCAAGGACGTTTCGATACGTATCCAAAACGTCGCGGCATCACGCGCGTTAAAGAGATGCTGGAGTCCGGCATTAACGTCTGCTTTGGTCACGATGATGTCTTCGATCCGTGGTATCCGCTGGGAACGGCGAATATGCTGCAAGTGCTGCATATGGGGCTGCATGTTTGCCAGTTGATGGGCTACGGGCAGATTAACGATGGCCTGAATTTAATCACCCACCACAGCGCAAGGACGTTGAATTTGCAGGATTACGGCATTGCCGCCGGAAACAGCGCCAACCTGATTATCCTGCCGGCTGAAAATGGGTTTGATGCGCTGCGCCGTCAGGTTCCGGTACGTTATTCGGTACGTGGCGGCAAGGTGATTGCCAGCACACAACCGGCACAAACCACCGTATATCTGGAGCAGCCAGAAGCCATCGATTACAAACGTTGA

SEQ ID NO.14序列：

MSNNALQTIINARLPGEEGLWQIHLQDGKISAIDAQSGVMPITENSLDAEQGLVIPPFVEPHIHLDTTQTAGQPNWNQSGTLFEGIERWAERKALLTHDDVKQRAWQTLKWQIANGIQHVRTHVDVSDATLTALKAMLEVKQEVAPWIDLQIVAFPQEGILSYPNGEALLEEALRLGADVVGAIPHFEFTREYGVESLHKTFALAQKYDRLIDVHCDEIDDEQSRFVETVAALAHHEGMGARVTASHTTAMHSYNGAYTSRLFRLLKMSGINFVANPLVNIHLQGRFDTYPKRRGITRVKEMLESGINVCFGHDDVFDPWYPLGTANMLQVLHMGLHVCQLMGYGQINDGLNLITHHSARTLNLQDYGIAAGNSANLIILPAENGFDALRRQVPVRYSVRGGKVIASTQPAQTTVYLEQPEAIDYKR

3.细胞存活实验

将细胞以每孔5,000个细胞的密度接种在96孔板中过夜。将细胞与病毒以确定的感染复数(MOI)一起孵育，MUM2B、MP41应用DMEM培养基，92.1应用RPMI-1640培养基，温度均为37度。对于oHSV-1-CD/5-FC测试，孵育24小时后，向oHSV-1-CD/5-FC组中每个孔加入100μl的5-FC(50μg/mL)。继续孵育48h。按照制造商的说明，使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8，Dojindo Molecular Technologies，Shanghai,China)确定细胞活力。使用SpectraMicroplate Reader在450nm下检测样品的吸光度。

4.蛋白质印迹分析

在收集细胞之前，将MUM2B，92.1和MP41细胞与病毒oHSV-1-CD或oHSV-1-CD/5-FC联合处理一起孵育48h。然后将细胞刮入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液(Thermo Scientific，Carlsbad，CA，USA)。在冰上孵育45分钟后，收集上清液，测定蛋白质浓度。将蛋白质(每泳道32μg)加载到凝胶上，以通过SDS-PAGE进行分离。分离后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，在室温下用含有5wt％脱脂奶粉的1X TBST(Tris缓冲盐水，0.1vol％Tween 20)封闭30分钟。用1X TBST洗膜，并在4℃下用一抗孵育过夜。表1列出了本发明所用的一抗。用1X TBST洗膜后，将膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(Thermo Scientific，31462，G-21040)或辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗(thermo,G-21040)在室温下孵育1小时。使用ECL检测系统检测到信号。ImageJ用于定量蛋白质印迹带。针对免疫荧光IF的二抗：荧光(Alexa Fluor555)标记山羊抗兔IgG(CST,4413S)或荧光(Alexa Fluor 488)标记山羊抗兔IgG(CST,4412S)。

表1.用于蛋白印记和免疫荧光的抗体(一抗)列表

5.透射电子显微镜(TEM)成像

MUM2B细胞在10cm

6.定量PCR

使用TRIzol试剂(Thermo Scientific)提取经过病毒处理过的冷冻细胞沉淀中的总RNA。按照制造商的说明书操作，使用逆转录系统试剂盒(Promega A3500,Fitchburg,WI,USA)进行cDNA合成。使用SYBR-Green PCR Master Mix(Applied Biosystems，Waltham，MA，USA)在QuantStudio 6Flex系统(Applied Biosystems)上采用常规操作进行qPCR分析。每个目标重复三次，将GAPDH用作内参。结果表示为2-

表2.qPCR中所用引物列表

7.ELISA

使用表3所示的ELISA试剂盒测量细胞因子，并按照制造商的说明进行汇总(表3)。使用Spectra Microplate Reader在450nm处检测样品吸光度。

表3.ELISA分析中所用的ELISA试剂盒列表

8.免疫荧光染色

MUM2B细胞在Lab-Tek实验室(Nunc,Roskilde,Denmark)中过夜培养。将病毒(MOI＝1)，100μl的5-FC(50μg/mL)和100μl的IL-6(50ng/mL)添加到不同的组中。从细胞接种起就在该装置中孵育，直至添加完药物。每个载玻片接种密度为10000个细胞。细胞在37℃下用4％多聚甲醛固定15分钟，并在室温下用0.3％TritonX-100透明化20分钟。然后，将载玻片用PBS洗涤并用山羊IgG封闭30分钟。稀释一抗(表1)并在4℃下孵育过夜。用PBS洗涤后，将载玻片与二抗一起孵育，具体二抗为荧光(Alexa Fluor 555)标记山羊抗兔IgG(CST,4413S)或荧光(Alexa Fluor 488)标记山羊抗兔IgG(CST,4412S)，再用PBS洗涤。最后，将腔室载玻片与带有DAPI(Invitrogen)的Prolong gold antifade Reagent试剂进行封片。使用Leica Aperio AT2和Leica DM IRB仪器捕获荧光图像。使用ImageJ分析积分光密度(IOD)。

肿瘤组织切片取自将病毒注射入肿瘤两周后获得的动物标本。如前所述，进行免疫荧光染色。简而言之，将样品固定在4％多聚甲醛中并包埋在石蜡中。将组织玻片用山羊血清封闭，并与一抗(表1)在4℃孵育过夜。第二天，将样品与二抗在室温下孵育60分钟，二抗为FITC荧光(Alexa Fluor 555)标记山羊抗兔IgG(CST,4413S)或Cy3荧光(Alexa Fluor488)标记山羊抗兔IgG(CST,4412S)，然后使用DAPI染色以便观察细胞核。使用水性封片介质(Thermo Scientific)进行封片。

9.构建裸小鼠异种肿瘤种植模型

所有体内实验均根据赫尔辛基宣言和动物保管和使用指导原则(DHEW出版，NIH80-23)进行。使用六周龄的雄性BALC/c裸鼠(每组n＝5，北京为通利华)。建立皮下异种移植肿瘤动物模型，将MUM2B细胞一次注射到小鼠的右侧腹股沟(right flank)(2×10

用MUM2B细胞(1×10

10.IVIS成像

体外试验：利用IVIS光谱获得生物荧光素酶影像。与病毒oHSV-1-CD或联合处理oHSV-1-CD/5-FC孵育48小时后，即可获得体外图像。孵育时培养基为100μL含0.5mg/mL D-荧光素的含10vol％胎牛血清的DMEM培养基。

单独治疗为：加入oHSV-1-CD后72h成像。联合治疗为加入oHSV-1-CD 24h后加入5-FC，再孵育48h，再成像。

小鼠体内试验：在第0天(注射病毒之前)，注射病毒后第7天和注射病毒后第14天获得生物荧光素酶图像。每只小鼠IVIS检测之前5min腹膜内注射100μL15 mg/mL D-荧光素。分析图像并获得ROI值。

单独治疗为：加入oHSV-1-CD后10天成像。联合治疗为加入oHSV-1-CD 10天后加入5-FC，再孵育48h，再成像。

11.肿瘤体积，动物体重和存活率

每三天测量一次肿瘤体积和动物体重至治疗后第24天，并追踪生存时间。

12.统计分析

所有数据均表示为平均值±标准差。使用Student’s t检验进行统计分析。使用Kaplan-Meier方法和对数秩检验分析生存率。GraphPad Prism 7.0用于准备所有图形并进行统计分析。P<0.05被认为是显著的。星号用于表示数字的重要性。*，p<0.05；**，p<0.005；***，p＜0.0005；p＜0.0005。****，p<0.00005；NS，无统计学意义。

二、实施例

实施例1.人源UM细胞系对oHSV-1骨架敏感性测试。

分别以材料和方法第1节所述人UM细胞系MUM2B、92.1和MP41为模型检测oHSV-1对UM的敏感性。用这三种细胞系代表UM的主要基因型。采用材料和方法第3节所述细胞存活实验方法测试oHSV-1载体对UM细胞的敏感性(图2)。结果显示，UM细胞以剂量依赖性方式对oHSV-1敏感。这三个细胞系中每一个的IC

细胞接种24小时后，用稀释的oHSV-1代替培养基，该稀释的oHSV-1加入到完全培养基中，针对MUM2B和MP41细胞，采用10％胎牛血清的DMEM培养基，针对92.1细胞系，采用10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，稀释度与细胞活力数值参见图2。与病毒孵育48小时后，在3种人葡萄膜黑色素瘤细胞系中进行了细胞存活实验。IC

实施例2.溶瘤性HSV-1对MUM2B细胞表型和基因表达的影响测试

为了进一步测试oHSV-1的杀灭肿瘤的有效性，根据材料和方法第5节的方法，使用电子显微镜TEM观察oHSV-1感染后MUM2B细胞(感染剂量MOI为0.1，感染时间72h)的超微结构(图3A)。在细胞核和细胞浆中观察到该病毒(黑色箭头)。与未感染的细胞相比，感染细胞中的微绒毛减少了(白色箭头)。这些数据表明EMT(上皮-间质转化，epithelial-mesenchymal transition)过程被oHSV-1感染所抑制。

接下来，以MUM2B细胞为对照，以oHSV-1感染为测试组，感染剂量MOI为0.1，本发明进一步检测oHSV-1感染是否能抑制EMT。使用表2所示引物，通过常规的qPCR测试EMT标志基因的表达丰度，包括间充质标志基因TWIST1，ZEB1，CD44和DPD和上皮标志基因CDH1、GAPDH用作内参(图3B)。DPD表达对于EMT是必不可少的，其中DPD活化产生的二氢嘧啶在细胞内的积累促进了EMT。本发明观察到间充质标志物表达的明显减少和上皮标志物表达的增加。

病毒感染72h后，使用表1所示抗体，根据材料和方法第4节的方法，使用蛋白质印迹法检测相关蛋白质水平(图3C)。以β-Actin为内参，蛋白质印迹结果显示，病毒处理后，DPD(～110kDa)和TWIST1(～26kDa)水平降低，CDH1(～135kDa)水平升高。这些结果与基于qPCR测定的用oHSV-1治疗后对EMT的抑制的判断一致。

接下来，以前述针对oHSV-1操作相同的方法和操作步骤，本发明检查了材料和方法第2节的方法重建的oHSV-1-CD病毒是否能像oHSV-1骨架一样抑制EMT表型。进行了qPCR和蛋白印迹分析(图3B和3C)，oHSV-1-CD的基因和蛋白质表达与oHSV-1的情况相似。这些数据表明，oHSV-1-CD的构建不影响oHSV-1的功能。基于这些研究，本发明进一步测试oHSV-1-CD/5-FC的功效。

图3示出了溶瘤性HSV-1载体导致PDP的下调并抑制EMT表型。A.未处理的MUM2B细胞和oHSV-1载体处理的MUM2B细胞的TEM图像。(黑色箭头：病毒；白色箭头：微绒毛)。比例尺，500nm。B.通过qPCR分析检测在非病毒感染组(对照)，oHSV-1载体感染组和oHSV-1-CD感染组中DPD，TWIST1，ZEB1，CD44和CDH1的mRNA表达水平。GAPDH被用作内参。使用Student-t检验对数据进行统计分析，数值以平均值±标准差表示。*，p<0.05；**，p<0.005；***，p＜0.0005；p＜0.0005。****p<0.00005，分别与空白对照细胞的数据相比。C.通过蛋白印迹检测三种细胞种对照组，载体组oHSV-1和oHSV-1-CD组中DPD，TWIST1，CDH1的表达。β-肌动蛋白用作内参。

实施例3.oHSV-1-CD/5-FC对UM细胞系有效性检测

使用材料和方法第2节的方法构建的oHSV-1-CD，针对oHSV-1-CD/5-FC模型，进行体外实验以确定该重组病毒是否在UM细胞系中起作用。使用MUM2B，92.1和MP41三种人UM细胞系检查oHSV-1-CD/5-FC治疗的功效。使用材料和方法第10节的方法，在每块板中，从左到右以0MOI、0.001MOI、0.01MOI、0.1MOI、1MOI、10MOI的量，接种5,000个细胞，oHSV-1-CD/5-FC组中5-FC浓度为50μg/mL，重复三行。通过IVIS图像显示每种处理内的灰度下降。与仅使用oHSV-1-CD的组相比，在接受联合治疗的细胞中IVIS灰度的下降明显更大(图4A)。测量ROI以量化IVIS图像中的像素强度(图4B)。这说明MOI升高后细胞活力的明显下降，而与5-FC的联合治疗则增强了杀伤作用。采用材料和方法第3节所述细胞存活实验方法，进行细胞存活实验以确认该结果(图4C)。针对MUM2B细胞：oHSV-1-CD的IC

测试了不同的5-FC浓度以检查溶瘤病毒中自杀基因的有效性(图4D)，采用材料和方法第3节所述细胞存活实验方法，使用MUM2B细胞测试。在低MOI下，自杀基因的功效更为显着。另外，将5-FC浓度提高到50μg/mL以上不会改善治疗效果。因此，处理中5-FC的最佳浓度为50μg/mL。在不同时间段后检查细胞活力(图4E)。在有或没有5-FC的低MOI(MOI＝0.01)下观察到差异。但是，治疗后第3天细胞活力下降，并且被认为是时间依赖性的。在第6天左右，最低和最高MOI的生存能力都趋于一致。这些数据证明了这种方法可用于反映体内的治疗情况，此时病毒最有可能处于低MOI。

使用表1所示抗体，根据材料和方法第4节的方法，将蛋白印迹检测用于评估病毒感染后的CD表达，感染剂量0.1MOI。感染后24小时检测到CD(～48kDa)的表达(图4F)。间接评估了5-FU对胸苷酸合酶(TS，～30kDa)的抑制作用(图4G)。实验结果表明，在联合治疗组中，TS的上调可能是由于5-FU的转化所致。

图4示出了溶瘤病毒oHSV-1-CD/5-FC对UM细胞系治疗效果的情况。A.IVIS图像显示每种处理内的灰度下降，在联合治疗组(含50μg/mL 5-FC)中观察到灰度下降更明显。B.在IVIS图像中测量量化的像素强度。C.在oHSV-1-CD和oHSV-1-CD/5-FC处理的3种人葡萄膜黑色素瘤细胞系中测量了细胞活性。D.在不同的5-FC浓度下检查细胞活性。E.在不同时间线检查细胞活性。F.蛋白质印迹显示病毒感染24小时后CD的表达。β-肌动蛋白用作内参。G.通过蛋白印迹检测CD和TS表达。β-肌动蛋白用作内参。

实施例4.溶瘤病毒下调IL-6/STAT3并抑制DPD表达。

为了进一步证明oHSV-1-CD的有效性，采用0.1MOI的病毒oHSV-1-CD，接种到MUM2B细胞，一份不添加5-FC，另一份5-FC浓度为50μg/mL，以MUM2B细胞为对照，使用材料和方法第7节的方法和表3中所述试剂盒进行检测培养基中的各种细胞因子，本发明使用收集的细胞上清对各种细胞因子进行了ELISA检测(图5A)。结果表明，在单独的病毒组和联合治疗组中，IL-6均降低。这表明IL-6受到极大影响，其信号传导途径在溶瘤病毒的治疗中起着重要作用。

由于IL-6信号传导是EMT的关键机制，因此，本发明接下来通过IL-6/STAT3信号传导通路检测IL-6是否通过激活该信号传导通路来增强EMT。采用1MOI的病毒oHSV-1或oHSV-1-CD，接种到5,000个MUM2B细胞，5-FC浓度为50μg/mL，IL-6浓度为10ng/mL。使用表1所示抗体，根据材料和方法第4节的方法，使用蛋白质印迹法测定相关蛋白质水平(图5B和5D)。STAT3在MUM2B细胞和IL-6治疗组中高度磷酸化。oHSV-1-CD和联合治疗导致磷酸化STAT3，TWIST1和DPD的水平降低。IL-6处理导致磷酸化STAT3，TWIST1和DPD的水平升高。使用表1所示抗体，根据材料和方法第8节的方法，免疫细胞化学证实了这些结果(图5C)。综上所述，这些数据表明，oHSV-1-CD/5-FC联合治疗的治疗优势与体内逆转EMT和抑制IL-6信号传导的能力有关。

加入IL-6进行细胞活性测定(图5E(1))。将细胞活力重复三遍，并计算IC

图5示出了oHSV-CD/5-FC通过下调IL-6抑制EMT，并在体外下调DPD的情况。A.ELISA分析显示oHSV-1-CD和oHSV-1-CD/5-FC组的IL-6均降低。使用Student’s-t检验对数据进行统计分析，数值以平均值±标准差表示。**，与空白对照细胞相比，p＜0.005。B.oHSV-1-CD降低MUM2B细胞中IL-6信号的激活并降低DPD表达。β-肌动蛋白用作内参。C.免疫荧光染色确定了CDH1，CDH2，波形蛋白和DPD的表达。溶瘤病毒逆转了IL-6诱导的EMT表型。比例尺，100μm。D.B中印迹的定量。E.(1)额外的IL-6处理后的细胞活力测定。(2)细胞活力测定中IC

实施例5.oHSV-1-CD/5-FC在BALB/c裸小鼠异种肿瘤移植模型中诱导的抗肿瘤活性

为了鉴定oHSV-1-CD/5-FC的治疗效果，根据材料和方法第9节、第10节的方法，建立了BALB/c裸小鼠移植模型。将MUM2B细胞植入小鼠。在指定的时间使用5-FC(500mg/kg小鼠体重)(图6E)。IVIS图像和皮下异种移植的ROI定量清楚地表明，oHSV-1-CD组的肿瘤大小减小了，而oHSV-1-CD/5-FC组的这种效果增强了肿瘤杀伤作用(图6A和6B)。收集皮下肿瘤，确定其体积(图6C和6D)，并观察到明显减少。构建原位肿瘤模型以更准确地观察治疗效果。获得了IVIS图像和相关的ROI定量(图6F和6G)。计算了眼的体积，并显示出明显的体积减小(图6H)。

这些结果表明，oHSV-1-CD可有效治疗UM，而5-FC可增强该作用。注射病毒后24天内，体重没有显着差异(图6I)。这表明所给予的治疗对动物没有负面影响，并且毒性作用低。此外，对数秩检验结果显示，对照组，oHSV-1-CD和oHSV-1-CD/5-FC组三组的中位生存期分别为23、33和50天(p<0.05)(图6J)。该结果表明，与仅病毒组相比，病毒感染组的存活时间延长，并且在联合治疗组中明显延长。总体而言，这些结果表明，与oHSV-1-CD/5-FC联合治疗对UM疗效显着。

图6示出了oHSV-CD/5-FC在BALB/c裸小鼠异种肿瘤移植模型中诱导抗肿瘤功效。A.在不同组(每组n＝5只小鼠，图中只示出2只)中的皮下肿瘤异种移植物的IVIS图像，根据时间线对5-FC施用500mg/kg。B.A的ROI量化。C.不同组的腹股沟切除的皮下肿瘤。D.不同组中腹股沟切除的皮下肿瘤重量。E.体内研究时间表的方案，肿瘤种植后分别于第10天进行病毒治疗。之后每隔一天进行5-FC治疗。分别于病毒治疗前，第7天，及第14天进行小动物活体荧光成像采集图像。F.未感染的oHSV-1-CD和oHSV-1-CD/5-FC组(每组n＝5只小鼠，图中只示出3只)的原位异种移植物的IVIS图像。G.F的ROI量化。H.在肿瘤细胞植入后和不同治疗下测得的眼球体积。I.肿瘤细胞植入和治疗后原位异种移植的体重。J.带有异种移植物的原位UM肿瘤的存活曲线。对数秩检验，p<0.05，使用Student’s-t检验对数据进行统计分析，数值以平均值±标准差表示。*，p<0.05；**，p<0.005；***，p＜0.0005；p＜0.0005。****p<0.00005。

实施例6.溶瘤病毒在体内克服了DPD耐药性并抑制了IL-6信号激活

为了阐明oHSV-1-CD/5-FC治疗有效治疗的潜在机制，使用表1所示抗体，根据材料和方法第4节、第9节、第10节的方法，本发明分析了实施例5的异种移植模型中的EMT和IL-6信号通路。以移植了oHSV-1-CD的小鼠为对照，测试组腹腔注射500mg/kg小鼠体重的5-FC生理盐水溶液，免疫荧光用于检查三组中的这些成分(图7A)。注射病毒2周后获得肿瘤标本，并计算IOD(图7E)。

使用材料和方法第7节的方法和表3中所述试剂盒进行检测培养72h后培养基中的各种细胞因子，对各组小鼠血浆中的因子进行检测，在治疗组中观察到IL-6，p-STAT3，CDH2，波形蛋白和DPD的水平降低以及CDH1的水平升高。这些结果表明EMT在oHSV-1-CD和oHSV-1-CD/5-FC组中均受到抑制。这些结果通过蛋白质印迹分析证实(图7C)并定量(图7D)。

使用表1所示抗体，根据材料和方法第4节的方法，对各组小鼠血浆中的因子进行检测，与对照组相比，溶瘤病毒处理后CDH1表达增加，而p-STAT3，TWIST1和DPD下降。使用ELISA检查裸小鼠异种移植模型血清中的IL-6分泌(图7B)。在注射病毒的组中检测到血清IL-6的显着降低。综上所述，这些数据表明oHSV-1-CD/5-FC联合治疗的治疗优势是由于溶瘤病毒抑制DPD并通过体内IL-6信号通路发挥功能以逆转EMT的能力。

图7示出了溶瘤病毒在体内下调IL-6信号传导并抑制DPD表达。A.oHSV-1-CD治疗通过抑制异种移植肿瘤块中的IL-6/STAT3信号通路逆转EMT。在石蜡包埋的切片中对肿块进行免疫染色。比例尺，50μm。B.评估ELISA以确定异种移植物血清中的细胞因子水平。oHSV-1-CD降低血清中IL-6的水平。C.蛋白质印迹分析了从肿瘤提取中获得的相对标记蛋白的表达。β-肌动蛋白用作内参。D.C结果的定量印迹。E.A中免疫染色阳性细胞的定量。使用Student’s-t检验对数据进行统计分析，数值以平均值±标准差表示。*，p<0.05；**，p<0.005；***，p＜0.0005；p＜0.0005。****p<0.00005，分别与对照细胞相比。

UM是成人中最常见的眼内肿瘤，并且转移的发生率很高。UM的目前治疗方法仍然受限于摘除术和放射治疗，导致这种化疗耐药的癌症预后不良。因此，迫切需要新的策略来延长UM患者的生存期。本发明实现了一种带有大肠杆菌CD的新型重组oHSV-1，本发明在体外和体内证明了该病毒的治疗功效，并确定了病毒oHSV-1在UM中发挥作用的潜在分子机制。本发明检查了带有大肠杆菌CD的新型重组oHSV-1的抗肿瘤功效。本发明确定了溶瘤病毒在UM细胞系中的功效。体内实验表明，用这种病毒进行治疗可减少肿瘤体积并提高生存率。本发明进一步证明了oHSV-1-CD/5-FC治疗的分子机制。溶瘤病毒下调IL-6，从而逆转EMT表型。在5-FU代谢中作为限速酶起作用的DPD也被下调。因此，通过下调DPD和抑制EMT可以协同增强oHSV-1-CD/5-FC的疗效。本发明首次将溶瘤HSV-1载体引入了UM。出乎意料的是，细胞生存力分析表明，UM对oHSV-1载体的敏感性高于对腺病毒的敏感性。oHSV-1载体的高效率为治疗UM提供了新的策略。基于本发明的新发现，即用oHSV-1进行治疗会导致EMT表型的抑制，本发明研究了UM细胞中从间质表型向上皮表型的转变。EMT的特点是具有类似干细胞的特性，可失去细胞粘附力，并具有迁移能力，使细胞更能够局部侵袭并转移至远处。考虑到其具有侵略性的肿瘤行为，EMT还与化疗耐药相关。研究已将DPD功能与获得性肿瘤对5-FU化疗的耐药性及其在EMT中的重要作用联系起来。DPD表达较低的患者通过减少药物分解代谢而体验到深远的5-FU治疗功效。本发明发现UM细胞系对5-FU的敏感性较低(图8)，这使得oHSV-1-CD和5-FC的组合成为一种潜在的治疗方法。针对MUM2B，92.1和MP41细胞系，参考材料和方法第10节的方法，在每块板中，从左到右以添加0μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM的5-FC，重复三行。同为细胞杀伤实验。将细胞以每孔5,000个细胞的密度接种在96孔板中过夜。将细胞与混有50μg/mL的5-FU一起孵育48h，按照制造商的说明，使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8，Dojindo Molecular Technologies，Shanghai,China)确定细胞活力。使用Spectra Microplate Reader在450nm下检测样品的吸光度。

图8示出了5-FU对人葡萄膜黑色素瘤细胞株显示较小的敏感性。A.IVIS图像显示5-FU处理的辐射下降。B.在IVIS图像中测量量化的像素强度。C.在5-FU处理的3种人葡萄膜黑色素瘤细胞系中测量了细胞活力，它们的IC

图9示出了IL-6和DPD在葡萄膜黑色素瘤患者的肿瘤标本中表达良好(n＝9)。A.H&E中UM患者肿瘤块的显微照片。IF是红色的IL-6和绿色的DPD的代表性石蜡包埋切片。比例尺，50μm。B.A中免疫染色阳性细胞的定量。

图10示出了UM样品中DPD的表达与IL-6和STAT3正相关(n＝79)。A.使用GEPIA2平台对TCGA数据库进行分析，显示DPD与IL-6或STAT3在mRNA水平上的相关性。GAPDH用作标准化基因。B.在TCGA数据库中表达不同水平的DPD的UM患者的总生存。

5-FU是一种能够扩散进入和扩散出细胞的小分子，使“旁观者效应”成为CD/5-FC自杀基因系统的特殊特征。但是，这种自杀基因系统无法靶向特定细胞。本发明将oHSV-1与CD/5-FC系统组合在一起，以创建oHSV-1-CD/5-FC组合治疗。通过体外和体内实验，本发明发现oHSV-1-CD/5-FC在治疗UM患者方面具有广阔的前景。本发明观察到病毒感染后IL-6受到抑制。HSV-1编码的基因γ

总而言之，本发明首次证明了oHSV-1-CD/5-FC在体外和体内均可有效治疗UM，并且在异种移植动物模型中可延长总体生存期。本发明的结果表明，oHSV-1-CD/5-FC治疗的抗肿瘤功效部分归因于IL-6的减少。EMT表型的变化表明oHSV-1-CD/5-FC处理可抑制IL-6/STAT3信号通路。溶瘤病毒和自杀基因表达的联合作用通过DPD下调提高了5-FU抗肿瘤功效。本发明为未来研究提供了坚实的基础，为支持oHSV-1-CD/5-FC联合治疗作为UM患者的临床新疗法提供坚实的证据。

由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

序列表

<110> 北京市神经外科研究所

<120> 溶瘤病毒在葡萄膜黑色素瘤治疗上的应用、治疗效果的标记物及其检测试剂

<130> C1CNCN200742

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgttccact tcggccaaga a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagtcgtgtg cttgatgtca t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcggaagat catccccacg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctgcagctt gccatcttgg a 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccaggtgtaa gcgcagaaa 19

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcagtttgt cttcatcatc tg 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggacaccat ggacaagttt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgtccgaga gatgctgtag 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttgcaccggt cgacaaagga c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggattccag aaacggaggc c 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctgcaccacc aactgcttag c 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cttcaccacc ttcttgatgt c 21

<210> 13

<211> 1284

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 13

atgtcgaata acgctttaca aacaattatt aacgcccggt taccaggcga agaggggctg 60

tggcagattc atctgcagga cggaaaaatc agcgccattg atgcgcaatc cggcgtgatg 120

cccataactg aaaacagcct ggatgccgaa caaggtttag ttataccgcc gtttgtggag 180

ccacatattc acctggacac cacgcaaacc gccggacaac cgaactggaa tcagtccggc 240

acgctgtttg aaggcattga acgctgggcc gagcgcaaag cgttattaac ccatgacgat 300

gtgaaacaac gcgcatggca aacgctgaaa tggcagattg ccaacggcat tcagcatgtg 360

cgtacccatg tcgatgtttc ggatgcaacg ctaactgcgc tgaaagcaat gctggaagtg 420

aagcaggaag tcgcgccgtg gattgatctg caaatcgtcg ccttccctca ggaagggatt 480

ttgtcgtatc ccaacggtga agcgttgctg gaagaggcgt tacgcttagg ggcagatgta 540

gtgggggcga ttccgcattt tgaatttacc cgtgaatacg gcgtggagtc gctgcataaa 600

accttcgccc tggcgcaaaa atacgaccgt ctcatcgacg ttcactgtga tgagatcgat 660

gacgagcagt cgcgctttgt cgaaaccgtt gctgccctgg cgcaccatga aggcatgggc 720

gcgcgagtca ccgccagcca caccacggca atgcactcct ataacggggc gtatacctca 780

cgcctgttcc gcttgctgaa aatgtccggt attaactttg tcgccaaccc gctggtcaat 840

attcatctgc aaggacgttt cgatacgtat ccaaaacgtc gcggcatcac gcgcgttaaa 900

gagatgctgg agtccggcat taacgtctgc tttggtcacg atgatgtctt cgatccgtgg 960

tatccgctgg gaacggcgaa tatgctgcaa gtgctgcata tggggctgca tgtttgccag 1020

ttgatgggct acgggcagat taacgatggc ctgaatttaa tcacccacca cagcgcaagg 1080

acgttgaatt tgcaggatta cggcattgcc gccggaaaca gcgccaacct gattatcctg 1140

ccggctgaaa atgggtttga tgcgctgcgc cgtcaggttc cggtacgtta ttcggtacgt 1200

ggcggcaagg tgattgccag cacacaaccg gcacaaacca ccgtatatct ggagcagcca 1260

gaagccatcg attacaaacg ttga 1284

<210> 14

<211> 427

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 14

Met Ser Asn Asn Ala Leu Gln Thr Ile Ile Asn Ala Arg Leu Pro Gly

1 5 10 15

Glu Glu Gly Leu Trp Gln Ile His Leu Gln Asp Gly Lys Ile Ser Ala

20 25 30

Ile Asp Ala Gln Ser Gly Val Met Pro Ile Thr Glu Asn Ser Leu Asp

35 40 45

Ala Glu Gln Gly Leu Val Ile Pro Pro Phe Val Glu Pro His Ile His

50 55 60

Leu Asp Thr Thr Gln Thr Ala Gly Gln Pro Asn Trp Asn Gln Ser Gly

65 70 75 80

Thr Leu Phe Glu Gly Ile Glu Arg Trp Ala Glu Arg Lys Ala Leu Leu

85 90 95

Thr His Asp Asp Val Lys Gln Arg Ala Trp Gln Thr Leu Lys Trp Gln

100 105 110

Ile Ala Asn Gly Ile Gln His Val Arg Thr His Val Asp Val Ser Asp

115 120 125

Ala Thr Leu Thr Ala Leu Lys Ala Met Leu Glu Val Lys Gln Glu Val

130 135 140

Ala Pro Trp Ile Asp Leu Gln Ile Val Ala Phe Pro Gln Glu Gly Ile

145 150 155 160

Leu Ser Tyr Pro Asn Gly Glu Ala Leu Leu Glu Glu Ala Leu Arg Leu

165 170 175

Gly Ala Asp Val Val Gly Ala Ile Pro His Phe Glu Phe Thr Arg Glu

180 185 190

Tyr Gly Val Glu Ser Leu His Lys Thr Phe Ala Leu Ala Gln Lys Tyr

195 200 205

Asp Arg Leu Ile Asp Val His Cys Asp Glu Ile Asp Asp Glu Gln Ser

210 215 220

Arg Phe Val Glu Thr Val Ala Ala Leu Ala His His Glu Gly Met Gly

225 230 235 240

Ala Arg Val Thr Ala Ser His Thr Thr Ala Met His Ser Tyr Asn Gly

245 250 255

Ala Tyr Thr Ser Arg Leu Phe Arg Leu Leu Lys Met Ser Gly Ile Asn

260 265 270

Phe Val Ala Asn Pro Leu Val Asn Ile His Leu Gln Gly Arg Phe Asp

275 280 285

Thr Tyr Pro Lys Arg Arg Gly Ile Thr Arg Val Lys Glu Met Leu Glu

290 295 300

Ser Gly Ile Asn Val Cys Phe Gly His Asp Asp Val Phe Asp Pro Trp

305 310 315 320

Tyr Pro Leu Gly Thr Ala Asn Met Leu Gln Val Leu His Met Gly Leu

325 330 335

His Val Cys Gln Leu Met Gly Tyr Gly Gln Ile Asn Asp Gly Leu Asn

340 345 350

Leu Ile Thr His His Ser Ala Arg Thr Leu Asn Leu Gln Asp Tyr Gly

355 360 365

Ile Ala Ala Gly Asn Ser Ala Asn Leu Ile Ile Leu Pro Ala Glu Asn

370 375 380

Gly Phe Asp Ala Leu Arg Arg Gln Val Pro Val Arg Tyr Ser Val Arg

385 390 395 400

Gly Gly Lys Val Ile Ala Ser Thr Gln Pro Ala Gln Thr Thr Val Tyr

405 410 415

Leu Glu Gln Pro Glu Ala Ile Asp Tyr Lys Arg

420 425