一种快速富集霍乱弧菌的偶联特异性单克隆抗体的免疫磁珠及其制备方法

摘要

一种快速富集霍乱弧菌的偶联特异性单克隆抗体的免疫磁珠及其制备方法。本发明中单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列ETS，LCDR3包含如SEQ ID NO:2所示的序列；所述重链可变区的HCDR1～HCDR3分别包含如SEQ ID NO:3、4和5所示的序列。本发明基于抗霍乱弧菌的特异性单克隆抗体(VC27112)建立了霍乱弧菌免疫磁珠富集分离方法，该方法具有快速、捕获率高、特异性高和敏感性好的特点。

说明书

技术领域

本发明属于病原菌分离技术领域，具体涉及一种快速富集霍乱弧菌的偶联特异性单克隆抗体的免疫磁珠及其制备方法。

背景技术

食源性病原微生物是引发食品安全问题的主要因素，具有群发、暴发、宿主范围广、传播速度快和社会影响与控制难度大等特点，严重时会引起社会恐慌，危及社会安定。海洋弧菌污染是威胁水和水产品质量的重要问题之一，其中，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起的急性肠道传染病，具有发病急、传播快、流行范围广等特征，曾在世界上发生过几次大流行，至今仍未完全平息，是我国传染病法规定的甲类传染病，也是当前三种国际检疫传染病之一。养殖用水在霍乱的传播及流行中起着重要作用，霍乱弧菌随水体流动、水/海产品及其运输而传播。近年来，国内外关于在鲑鱼、甲鱼、鲍鱼、牛蛙等养殖用水中检测到霍乱弧菌的报道一直不断，水中或鱼类、毛蚶、螺蛳等海产品表面或体内常存留有各种致病性弧菌等，若生食或食用时加热不彻底，可引起急性胃肠炎、菌血症、败血症、尿路感染、皮肤和软组织感染、脑膜炎、细菌性肺气肿等疾病。

对于食品中病原微生物的分析，往往需要在病原菌浓度足够高时还能做到实时检测，除了提高检测方法的灵敏性，还可以利用样品前处理方法，去除水或水产品成分中存在干扰性物质，去除难以忽略的背信号景干扰，以此提高后续检测方法的灵敏度及特异性。在众多预富集技术中，基于抗原抗体反应的免疫磁分离技术组合各种下游检测技术是目前病原微生物检测体系研究的热点，该技术已经广泛地用于病原微生物的快速富集和检测应用中。将免疫磁珠分离技术用于样品前处理有诸多优点，如缩短微生物检测的培养时间、去除基质中影响测定的物质、减少需提供的样本量等等，从而实现微生物的快速富集，尤其对于原始浓度低的样品，预富集技术有利于提高分析方法的准确度，拓展应用范围，同时还可以帮助改进检测低水平病原或散发性污染所需的采样技术。

基于抗原抗体反应的免疫磁分离技术中，获得特异性单克隆抗体是其最关键的技术，亲和力高、特异性好的单克隆抗体是免疫磁珠技术达到高捕获率和高特异性的必要条件，单克隆抗体与磁珠偶联制备免疫磁珠，进一步通过优化多种反应条件，在磁场的作用下，可实现样品中的病原微生物的快速、高效和特异性的富集，进而用于目标病原的分离和检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中存在的富集和检测食品和水中霍乱弧菌的方法的快速、特异性、捕获率和敏感度难以兼顾等缺陷，提供一种快速富集霍乱弧菌的偶联特异性单克隆抗体的免疫磁珠及其制备方法。

本发明提供一种抗霍乱弧菌的特异性单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列ETS，LCDR3包含如SEQ ID NO:2所示的序列；所述重链可变区的HCDR1～HCDR3分别包含如SEQ ID NO:3、4和5所示的序列。

较佳地，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:6所示的序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的序列。

更佳地，所述单克隆抗体的轻链包含如SEQ ID NO:7所示的序列，重链包含如SEQID NO:9所示的序列。

本发明还提供一种标记有如上所述单克隆抗体的捕获霍乱弧菌的免疫磁珠。

所述的捕获霍乱弧菌的免疫磁珠可通过本领域常规的制备方法进行制备。如，所述制备方法包括使用活化的免疫磁珠标记所述的单克隆抗体。

其中，所述免疫磁珠可为本领域常规，例如：海狸公司4种不同规格的磁珠，DM3-020(直径180nm)、DM3-050(直径750nm)、70104-5(直径1000nm)和70102-5(直径2000nm)。本发明中优选直径为1～2μm的免疫磁珠。

本发明中活化免疫磁珠的方法优选包含如下步骤：

(1)将待活化的免疫磁珠与MEST溶液混合；所述MEST溶液的pH优选6；

(2)加入EDC和NHS的混合溶液。

较佳地，步骤(2)中所述EDC和所述NHS的体积比为1:1，浓度均为5mg/mL。

本发明还通过如上所述的捕获霍乱弧菌的免疫磁珠在富集分离霍乱弧菌中的应用。

较佳地，所述富集包括以下步骤：

(1)将如上所述的捕获霍乱弧菌的免疫磁珠与样品在偶联缓冲液中孵育40～50min；

(2)计算捕获率。

所述富集的反应体系的体积与磁珠的相对用量可为本领域常规，优选5mL:0.8mg或者10mL:1.2mg。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

为建立针对霍乱弧菌的快速富集和检测的方法，本研究利用霍乱弧菌免疫小鼠，经细胞融合筛选，制备了针对霍乱弧菌的单克隆抗体，该抗体特异性好、敏感性高。最终，本发明制备得到的单克隆抗体的效价高(例如可达1:5120000)，且所述单克隆抗体的特异性强；并适用于单克隆抗体免疫磁珠的制备，制备得到的单克隆抗体免疫磁珠对于霍乱弧菌具有较高的捕获率，可达90％以上；具有较高的特异性，不与其他弧菌和常见食源性细菌反应；敏感性强，当捕获体系内细菌数量约为10

附图说明

图1显示不同粒径的磁珠对霍乱弧菌捕获率的影响。

图2显示最适免疫磁珠使用量的确定。

图3显示不同捕获时间对霍乱弧菌捕获率的影响。

图4显示特异性检测结果。

图5显示敏感性检测结果。

图6显示不同的反应体系对磁珠捕获率的影响。

图7显示5ml捕获系统优化。

图8显示10mL捕获系统优化。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

以下实施例中涉及：4种霍乱弧菌(霍乱弧菌VC0901、霍乱弧菌VC0903、霍乱弧菌VC0904、霍乱弧菌VC0907)、4种非霍乱弧菌属(副溶血弧菌SH112、溶藻弧菌ATCC1749、拟态弧菌Vm-290、创伤弧菌ATCC27562)和4种非弧菌菌株(沙门氏菌CVCC503、大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌CICC21662、坂崎肠杆菌ATCC21550)。

其中，所有弧菌菌株都在新鲜的3％NaCl LB培养基上生长，并在37℃下培养。其他细菌菌株在新鲜LB培养基上培养，并在37℃下培养。

BALB/c小鼠和昆明鼠购自上海杰思捷生物有限公司。

Prime STAR DNA聚合酶、限制性内切酶、胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒购自天根公司；卡那霉素(Kan)购自Invitrogen公司；胎牛血清(FBS)和DMEM培养基购自英潍捷基(上海)贸易有限公司。弗氏佐剂、聚乙二醇(PEG 6000)、次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸腺嘧啶脱氧核苷(T)、青链霉素(PS)及L-谷氨酰胺(LG)均是美国Sigma公司的产品；脱脂奶粉购自生工生物工程股份有限公司；无血清细胞冻存液购自苏州新赛美生物技术有限公司；抗体亚型鉴定试剂盒购自Southern Biotech有限公司。Trizol试剂是Invitrogen公司的产品；Prime Script去DNA反转录试剂盒和是Thermo生物科技有限公司的产品。

HT贮存液(100×)：38.8mg胸腺嘧啶脱氧核苷和136.1mg次黄嘌呤加入50mL ddH

A贮存液(100×)：1.76mg氨基蝶呤加入适量dd H

20％FBS培养基：1mL青链霉素(PS)、1mL L-谷氨酰胺(LG)、20mL胎牛血清(FBS)和78mL DMEM，4℃保存备用。

HT培养基：1mL LG、1mL PS、1mL HT、20mL FBS和77mL DMEM，4℃保存备用。

HAT培养基：1mL A、1mL HT、1mL LG、1mLPS、20mL FBS和76mL DMEM，4℃保存备用。

ELISA包被液(pH 9.6)：0.848g Na

ELISA底物显色液：A液配制方法为冰醋酸6mL，乙酸钠2.45g和30％双氧水0.3mL加入ddH

ELISA封闭液(5％脱脂乳)：5g脱脂乳溶于PBST定容至100mL。

ELISA终止液(2M H

ELISA洗涤缓冲液(1×PBST，pH 7.2)：8.0g NaCl、2.9g Na

乳化仪购自Amalgamator公司，台式低温离心机购自Thermo Fisher科技有限公司；CO

LB液体培养基：10g NaCl、5g酵母浸出物、10g胰蛋白胨定容至1L去离子水中，pH调节至7.4，121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。LB固体培养基：10g NaCl、5g酵母浸出物、10g胰蛋白胨和15g琼脂粉定容至1L去离子水中，调节pH至7.4，121℃高压灭菌15min，配制平板后4℃保存备用。BHI液体培养基、TSB液体培养基和THB液体培养基购自BD生物技术有限公司。2-(N-吗啉基)乙磺酸,4-吗啉乙磺酸(MES)：购自SIGMA公司，货号：M3671-50G。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)：购自Thermo scientific公司，货号：PA184225。N-羟基邻苯二甲酰亚胺(NHS)：购自SIGMA公司。活化缓冲液MEST：取0.488g的MES溶于100mL ddH

实施例1霍乱弧菌免疫原的制备

将霍乱弧菌培养至OD

实施例2动物免疫程序以及血清效价测定

初次免疫原为菌液和等量的弗氏完全佐剂，第2-4次是霍乱弧菌和等量的弗氏不完全佐剂，乳化90s后的进行小鼠免疫。第5次腹腔免疫时用生理盐水稀释霍乱弧菌至100μL小鼠的免疫程序如表1。

表1小鼠免疫程序

将免疫Balb/C小鼠，第3次免疫后将收集小鼠血清，按1:2×10

小鼠在3免后第7-10d断尾取血，间接ELISA法测定小鼠的血清效价。实验结果显示，小鼠的血清效价在256×10

表2免疫后小鼠血清水平的ELISA检测

间接ELISA实验步骤：

(1)将灭活后的霍乱弧菌(等比混合)用ELISA包被液稀释至1.0×10

(2)包被结束后，弃去包被液，再使用洗涤缓冲液洗涤酶标板3次，向每孔中加入5％脱脂乳(200μL/孔)，置于37℃温箱封闭2h。

(3)封闭完成后，用洗涤缓冲液洗涤酶标板3次后即为霍乱弧菌抗体ELISA检测板，保存于4℃备用。

(4)用5％FBS的PBST(1×PBST，pH 7.2)对待检血清进行倍比稀释，将倍比稀释后的血清加入霍乱弧菌抗体ELISA检测板(每孔加入100μL)，置于37℃温箱孵育2h。

(5)洗涤缓冲液洗涤霍乱弧菌抗体ELISA检测板3次，每孔加入(1：2000)的稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体100μL，置于37℃孵育1h。

(6)孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤3次，向每孔中加入显色液100μL，置于37℃孵育15min后，加入50μL终止液，最后使用酶标仪读取OD

实施例3霍乱弧菌单克隆抗体的制备

1、培养骨髓瘤细胞(SP2/0)

将SP2/0细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴锅中至完全融化，加入提前准备7mL空白DMEM培养基于15mL离心管中，1000rpm，离心8min，弃去上清后，使用适量的DMEM完全培养基重悬SP2/0细胞，转移至细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO

2、饲养细胞的制备

将6-8周龄的昆明鼠通过眼球放血的方法处死，放入75％的酒精中浸泡5min。消毒结束后将小鼠腹部朝上固定于超净工作台内，使用经高压灭菌的剪刀和镊子按照常规操作沿腹白线剪开腹部皮肤，暴露腹膜，注意不要触碰腹膜。用5mL注射器将4mL DMEM培养基注入小鼠腹腔内，随后用镊子轻轻拍打小鼠腹腔50次左右，然后用原来的注射器从进针抽取腹腔中的培养基加入15mL离心管中，重复以上操作2-3次，将收集到的腹腔冲洗液移至无菌的离心管，低速离心10min后，弃去上清，用50ml的HAT培养基重悬饲养层细胞，将饲养层细胞滴加至96孔细胞培养板中，置于5％CO

3、细胞融合

(1)SP2/0细胞的准备：将生长状态良好的SP2/0细胞收集于离心管中，以1000rpm，8min离心后弃上清，重悬细胞并转移至融合管中。

(2)脾细胞的分离：将用于融合的小鼠进行安乐死，随后依次剪开小鼠开腹部皮肤、腹膜，充分暴露脏器，在小鼠内脏左侧，分离黏连在脾脏上的脂肪和其他结缔组织后，取出脾脏放入12孔细胞培养板，用空白DMEM培养基清洗表面后转入另一孔，用注射器吸取空白DMEM培养基反复冲洗脾脏，将脾细胞洗至透明，洗脱液以1000rpm，8min离心后弃上清，接着弃去上清，重悬备用。

(3)SP2/0和脾细胞的融合：混匀后转移至已经装有SP2/0细胞的融合管中，以1000rpm，8min离心并完全弃去上清，将融合管放在左手心拍打，剧烈震荡充分混匀两种细胞后，置于37℃温箱10min。在45s内时间均匀的加入1mL预热的PEG，作用90s后，适量的DMEM培养基终止PEG作用。接着将融合管在37℃作用10min后，以1000rpm，8min离心后弃去上清后用适量的20％FBS的HAT培养基重悬，稀释成不同浓度分别加入长有饲养层细胞的96孔板中(100μL/孔)，于37℃、5％CO

4、阳性细胞的筛选

每天适度观察生长状态，由于前3天最好不移动细胞培养板，所以暂时挑选其中一个观察。阳性细胞的筛选需要根据杂交瘤细胞生长状态，融合后8-10d观察细胞生长状态，筛选并标记每孔中仅有单克隆细胞团生长的孔。抽取各单克隆孔上清各100μL，另补足HAT培养基。利用间接ELISA方法进行测定，包被缓冲液分别将霍乱弧菌液释为1.0×10

5、阳性杂交瘤细胞的亚克隆

挑取细胞上清效价较高、生长状态良好的单克隆细胞株进行亚克隆。首先在显微镜下标记出阳性克隆的细胞位置，使用200μL的移液器吸取少量细胞转移至96孔细胞板中，用20％FBS的不完全培养基进行梯度稀释。于倒置显微镜下观察，选取每孔含有90-120个细胞的孔，将该孔中液体转移至10mL 20％FBS的不完全培养基中，吹打混匀。然后滴加至含饲养细胞的96孔细胞板中(100μ/孔)，置于37℃、5％CO

细胞融合后第3-4d，镜检所有细胞培养孔，标记有1-2个单克隆的96孔。细胞融合后第8-9d，挑选长有单克隆细胞的培养上清进行效价检测。随后，选择效价值高、特异性良好的单克隆细胞株进行亚克隆。

6、小鼠腹水的制备

向雌性Balb/C小鼠腹腔中每7d注射0.5mL灭菌的石蜡油，共注射3次。接着向小鼠腹腔内注射0.5mL亚克隆后的阳性细胞(浓度为2×10

实施例4单克隆抗体分析

1、效价及特异性测定

采用ELISA方法测霍乱弧菌特异性单克隆抗体的效价。使用包被缓冲液将灭活的霍乱弧菌VC0903菌液稀释为1×10

经过4次亚克隆后共筛选出1株单克隆抗体，命名为VC27112。以霍乱弧菌为包被原，间接ELISA方法测定腹水效价，具体方法同上。由结果(表3)可以看出，在稀释了5.12×10

表3单克隆抗体的效价测定

表4单克隆抗体的特异性测定

2、单克隆抗体的鉴定

用灭活的霍乱弧菌包被96孔酶标板，使用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒分别对收集到阳性抗体进行抗体亚型鉴定，一抗稀释倍数为1:10,000，二抗为试剂盒中的抗体按1:300稀释倍数添加。利用抗体亚型鉴定试剂盒对单抗的亚型鉴定结果显示，抗体的轻链类型皆为Kappa型，重链类型为IgG1型。

3、抗霍乱弧菌单抗序列的测定和分析

为了鉴定抗体序列，使用Trizol试剂从杂交瘤细胞中分离总RNA。具体步骤：1)Trizol裂解：用1mL Trizol重悬全部细菌，吹打混匀静置3-5min。(2)氯仿分相：每个样品加入0.2mL的氯仿(三氯甲烷)，剧烈震荡15s，室温放置充分作用3min后12,000rpm离心15min。(3)RNA沉淀：将上层水相转移至新的1.5mL无RNA酶EP管中，加入500μL的异丙醇使RNA分子沉淀，充分颠倒混匀。(4)RNA洗涤：轻轻吸出上清液(注意不要吸到白色沉淀)，在纸上控干，在沉淀中加入1mL 75％乙醇(750μL无水乙醇，250μL DEPC水，提前配制)，7,500rpm离心5min。(5)RNA溶解：弃上清，干燥10min。加入适量DEPC水吹打溶解，置于冰上，测OD

然后使用抗体恒定区特异性引物并利用Thermo逆转录试剂盒反转录为cDNA，并以相应的cDNA为模板用Ex Taq酶(Takara)和简并引物进行PCR扩增，随后测序，以获得单抗的重链和轻链的可变区序列。使用IgBLAST工具确定互补决定区(CDR)的位置。测序结果显示单抗可变区的序列的胚系基因家族的基因片段(表5)。

表5抗霍乱弧菌单抗可变区的胚系基因(IgBlast分析)

注：V

V

测序结果如下：

轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:10)：

注：加粗部分为可变区序列，非加粗部分为恒定区序列。

轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:7)：

注：加粗部分为可变区序列(SEQ ID NO:6)，蓝色部分为恒定区序列，*为终止密码子。

其中：

LCDR1：SSISY(SEQ ID NO:1)

LCDR2：ETS

LCDR3：HQRSSYPWT(SEQ ID NO:2)

重链核苷酸序列(SEQ ID NO:11)：

注：加粗部分为可变区序列，非加粗部分为恒定区序列。

重链氨基酸序列(SEQ ID NO:9)

注：加粗部分为可变区序列(SEQ ID NO:8)，非加粗部分为恒定区序列，*为终止密码子。

其中：

HCDR1：GFSLSTSGMG(SEQ ID NO:3)

HCDR2：IWWDDDK(SEQ ID NO:4)

HCDR3：SRIDPYYFDY(SEQ ID NO:5)

实施例5霍乱弧菌免疫磁珠的制备

1、免疫磁珠的活化

(1)取2mg(即200μL，10mg/mL)磁珠置于1.5mL EP管中，置于磁力架；静置1min，磁珠与上清分离后弃上清，加入500μL活化缓冲液(MEST，pH6.0)重悬磁珠，涡旋振荡器混合均匀，置于磁分离架上1min，弃上清，反复洗涤3次，每次1min，弃上清；

(2)加入200μL EDC(5mg/mL)和200μL NHS(5mg/mL)(现配现用)，混匀磁珠后，置于37℃摇床，200rpm/min，活化30min；

(3)取出，瞬离，放置磁力架1min，加入500μL活化缓冲液(MEST，pH6.0)，将磁珠混匀，转移到新的EP管中；

(4)磁分离，移除上清，500μL活化缓冲液(MEST，pH6.0)洗涤2次，用磁力架进行磁分离，移液器吸取上清，此时，磁珠表面的羧基已经活化，能够与带有伯胺基的生物配体进行共价偶联。

2、免疫磁珠标记单克隆抗体

(1)500μL偶联缓冲液MEST(MEST，pH7.0)洗涤1次，弃上清；

(2)取新EP管，加入500μL偶联缓冲液MEST(MEST，pH7.0)，吸取适量腹水与偶联缓冲液中涡旋震荡，将混合物吸入装有磁珠的EP管中，混匀后置于旋转培养仪，30rpm/min，室温反应2h；

(3)偶联后，轻柔瞬离，将EP管置于磁分离架，静置1min，500μL PBST轻柔洗涤3次；

(4)加入1mL封闭液进行封闭，EP管置于37℃摇床，200rpm/min，封闭至少30min(或者4℃过夜)；

(5)取出，轻柔瞬离，置于磁力架，静置，弃上清，PBST洗涤4次，每次1min，弃上清；

(6)加入600μL储存液，重悬免疫磁珠，4℃保存，待用。

3、免疫磁珠检测流程

各细菌培养条件均为37℃，180rpm摇床增菌。待OD600为1.0时，用PBST对菌液进行10倍(或5倍)梯度稀释，吸取稀释后的菌液涂LB平板，计算原始菌液浓度。同时，吸取稀释后的菌液加入到新的EP管中，取适量偶联后的免疫磁珠(提前轻柔混匀)于其混匀，置于旋转培养仪，30r/min，室温反应。捕获结束后，轻柔瞬离，置于磁力架。吸取上清100μL，涂LB平板，计算磁珠捕获后，上清残留细菌数量。后500μL PBST轻柔洗涤免疫磁珠1次，适量PBST将磁珠重悬混匀，吸取100μL挂LB平板，计算磁珠捕获菌数。免疫磁珠捕获率计算公式如下：

捕获率＝磁珠捕获菌数/(上清残留菌数+磁珠捕获菌数)

4、免疫磁珠检测条件的优化

1)免疫磁珠最佳直径的确定

免疫磁珠的直径变化可对特定细菌的捕获造成较大的影响。本实验以霍乱弧菌VC0903为目的菌，PBST梯度稀释至约10

不同粒径大小的磁珠制备的免疫磁珠效果不同，本次试验分别使用粒径为750、1000、1150、2000nm的磁珠制备免疫磁珠，用以捕获浓度为10

2)免疫磁珠最佳数量的确定

探索不同捕获时间对于捕获率的影响，以霍乱弧菌VC0903为目的菌，PBST梯度稀释至约10

如图2所示，使用量在0.2mg之前时，随着磁珠用量上升捕获率也随之上升；而在磁珠用量超过0.2mg后，捕获率趋于缓慢增加，为了实现最大捕获率，当霍乱弧菌浓度约为10

3)免疫磁珠最佳捕获时间的确定

探索不同捕获时间对于捕获率的影响，以霍乱弧菌VC0903为目的菌，PBST梯度稀释至约10

在10min-40min之间时，随着时间增长，捕获率也从60％达到91％。捕获率在40min后超过90％，之后时间内基本平稳。出于快速富集的需要，本次试验选择的最佳捕获时间为40min(图3)。

4)免疫磁珠检测方法的特异性检测

使用霍乱弧菌VC0901、霍乱弧菌VC0903、霍乱弧菌VC0904、霍乱弧菌VC0907、副溶血弧菌ATCC33847、溶藻弧菌ATCC1749、拟态弧菌ATCC33653、创伤弧菌ATCC27562、沙门氏菌CVCC503、大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌CICC21662等菌株检测免疫磁珠的特异性，实验方法同上。本实验重复3次，计算捕获率，确定免疫磁珠最佳直径。

如图4所示，对霍乱弧菌的捕获率均较高，除拟态弧菌ATCC33653外其余细菌捕获率均低于10％，其中溶藻弧菌ATCC1749、创伤弧菌ATCC27562、沙门氏菌CVCC503、大肠杆菌O157:H7ATCC35150、单核细胞增生李斯特菌CICC21662捕获率低于5％，证明本次制备出的免疫磁珠特异性良好。

5)免疫磁珠检测方法的敏感性检测

探索不同菌液浓度对于捕获率的影响，以霍乱弧菌VC0903为目的菌，PBST梯度稀释至约10

如图5，捕获体系内细菌数量约为10

6)不同反应体系对免疫磁珠捕获率的影响

探索不同反应体系对于捕获率的影响，以霍乱弧菌VC0903为目的菌，PBST梯度稀释至约10

如图6，随着体系体积的增长，捕获率有所下降。所以在反应体系5mL和10mL里进一步优化最佳磁珠量。

通过在5mL和10mL的反应体系中使用不同磁珠量进行捕获霍乱弧菌，结果表明，在5mL体系中磁珠量为0.8mg时捕获率可达到90％以上(图7)。在10mL体系中磁珠量为1.2mg时捕获率达到85％左右，且随着磁珠量的增加捕获率基本稳定(图8)。以上结果说明即使扩大体系，本发明中涉及的磁珠捕获率仍然达到85％以上，提示本发明制备的单克隆抗体和相应的免疫磁珠具有很好的应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

<120> 一种快速富集霍乱弧菌的偶联特异性单克隆抗体的免疫磁珠及其制备方法

<130> P21015561C

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR1

<400> 1

Ser Ser Ile Ser Tyr

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR3

<400> 2

His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR1

<400> 3

Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly

1 5 10

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR2

<400> 4

Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR3

<400> 5

Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 6

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Glu Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 7

<211> 213

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 轻链

<400> 7

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Glu Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro

100 105 110

Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn

130 135 140

Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn

145 150 155 160

Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr

180 185 190

Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 8

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 8

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Thr Ser Gly Asn Gln Ile

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 442

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 重链

<400> 9

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Thr Ser Gly Asn Gln Ile

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr

180 185 190

Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro

210 215 220

Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp

260 265 270

Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser

305 310 315 320

Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

325 330 335

Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln

340 345 350

Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe

355 360 365

Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu

370 375 380

Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe

385 390 395 400

Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn

405 410 415

Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

420 425 430

Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 10

<211> 642

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 轻链核苷酸序列

<400> 10

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtataagt tacatgcact ggtaccagca gaggccaggc 120

acctccccca aaagatggat ttatgagaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cctattactg ccatcagcgg agtagttacc catggacgtt cggtggaggc 300

accaagctgg aaatcaaacg ggctgatgct gcaccaactg tatccatctt cccaccatcc 360

agtgagcagt taacatctgg aggtgcctca gtcgtgtgct tcttgaacaa cttctacccc 420

aaagacatca atgtcaagtg gaagattgat ggcagtgaac gacaaaatgg cgtcctgaac 480

agttggactg atcaggacag caaagacagc acctacagca tgagcagcac cctcacgttg 540

accaaggacg agtatgaacg acataacagc tatacctgtg aggccactca caagacatca 600

acttcaccca ttgtcaagag cttcaacagg aatgagtgtt ag 642

<210> 11

<211> 1329

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 重链核苷酸序列

<400> 11

caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120

cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgacaagcgc 180

tataatccag ccctgaagag ccgactgaca gtctccaagg atacctccgg caaccagata 240

ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg ttctcgaata 300

gacccgtact actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcagccaaa 360

acgacacccc catctgtcta tccactggcc cctggatctg ctgcccaaac taactccatg 420

gtgaccctgg gatgcctggt caagggctat ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac 480

tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac 540

actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc 600

aacgttgccc acccggccag cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt 660

ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca 720

aagcccaagg atgtgctcac cattactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac 780

atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac 840

acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa 900

cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt 960

gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct 1020

ccacaggtgt acaccattcc acctcccaag gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg 1080

acctgcatga taacagactt cttccctgaa gacattactg tggagtggca gtggaatggg 1140

cagccagcgg agaactacaa gaacactcag cccatcatgg acacagatgg ctcttacttc 1200

gtctacagca agctcaatgt gcagaagagc aactgggagg caggaaatac tttcacctgc 1260

tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagcctctc ccactctcct 1320

ggtaaataa 1329