一种同时携带耐药基因cfr和lsa(E)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及其检测方法

摘要

本发明公开了一种同时携带耐药基因cfr和lsa(E)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及其检测方法。金黄色葡萄球菌Sta2868B2，保藏号：GDMCC No：61037。本发明提供了一种同时检测多重耐药基因cfr和lsa(E)的引物组及双重PCR检测方法。该方法具有良好的稳定性和特异性，通过对多组引物进行比较后选定的两对最佳引物；通过调整退火温度来进一步提高反应的特异性，本方法对cfr和lsa(E)的检测具有高度特异性，相互之间及与耐药基因无交叉反应，另外还具有较好的重复性；此外，利用本发明可以一次检测两种耐药基因，全部反应在2个小时内完成，省时省力。同时，利用本发明不需要昂贵的荧光PCR仪，也不需要合成昂贵的探针及相应的试剂，检测成本低，操作简便，利于医院和基层部门实验室应用推广。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种同时携带耐药基因cfr和lsa(E)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的用途。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种可引起严重的社区和医院获得性疾病(包括皮肤和软组织感染、感染性心内膜炎、坏死性肺炎、危及生命的败血症和中毒性休克综合征)的病原体(Diep et al.,2006)。近年来，金黄色葡萄球菌的耐药问题日益突出。其中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant S.aureus，MRSA)更成为国内外关注的焦点问题。MRSA不仅对β-内酰胺类抗菌药物耐药，而且对临床常用药物如四环素类、氨基糖苷类和大环内酯类等多种抗菌药物均可产生耐药，其发病率和死亡率超过艾滋病、SARS和禽流感(Kluytmans,2010)。2017年2月底，WHO甚至将其列入了全球十二种超级细菌的行列之中。一般来说，金黄色葡萄球菌的耐药性可通过点突变或可移动元件(如质粒、转座子或插入序列元件等)介导的耐药基因的水平转移而出现，而这些耐药基因可来源于同一物种的水平转移或其他相关物种(Ferrero et al.,1995；Gao et al.,2012；Tsiodras et al.,2001；Weigel et al.,2003；Weigel et al.,2007；Yan et al.,2016)。因此，耐药基因的出现，是导致细菌耐药的最主要原因。

cfr是一类由质粒介导的多药耐药基因，由德国联邦农业中心动物育种研究所的Stefan schwarz教授于2000年从患有呼吸道感染的小牛鼻腔中分离的一株松鼠葡萄球菌中得到。当时的药敏试验的结果显示，该菌株对四环素、红霉素、卡那霉素、氯霉素以及氟苯尼考均可以显示出耐药性。质粒分析结果发现该菌株携带6个质粒，大小在1.5kb～16.5kb不等。进行电转化试验并经过氟苯尼考筛选得到一个16.5kb大小的质粒pSCFS1，经克隆酶切实验，最终得到能介导对氯霉素和氟苯尼考耐药，编码349个氨基酸序列的开放阅读框，大小2kb的片段，命名为chloramphenicol-florfenicol resistance，简称为cfr(Schwarzet al.,2000)。进一步的研究发现，cfr基因编码的蛋白属于rRNA甲基转移酶，该转移酶的作用位点是23S rRNA的A2503和C2498位核苷酸，在进行A2503位的甲基化同时，还抑制着C2498位的甲基化。由于葡萄球菌23S rRNA中的氯霉素类药物结合位点和林可霉素结合位点存在着部分重叠，而且A2503位的甲基化导致了23S rRNA中上述氯霉素类药物和林可霉素类药物这两类的结合位点构型发生了变化，因而导致葡萄球菌产生对氯霉素和林可霉素的耐药(Kehrenberg et al.,2005)。此外，由于截短侧耳素类、恶唑烷酮类和链阳菌素A类药物均作用于革兰氏阳性菌中23S rRNA的转肽中心，而且A2503位和该转肽中心临近，因此cfr基因的存在还介导这三类药物的耐药。2006年long等人报道cfr使泰妙菌素(截短侧耳素类抗生素)对大肠杆菌的MIC增加了128倍，对金黄色葡萄球菌的MIC增加了2048倍(Longet al.,2006)。由此可见，cfr基因对于细菌的耐药有着深远的影响。

lsa(E)基因，属于ABC转运基因，编码ABC转运蛋白，能同时介导三类不同化学结构的抗菌药物产生耐药(林克胺类、截短侧耳素类和链阳菌素A类)，这三类抗菌药物均为人医和兽医临床上非常重要的抗感染药物。值得注意的是，lsa(E)基因常存在于多重耐药簇aadE-spc-lsa(E)-lnu(B)-tnp上，该基因簇通常含有多个耐药基因，分别为介导氨基糖苷类抗生素耐药的基因aadE和spc，林可酰胺-截短侧耳素-链阳菌素A类的耐药基因lsa(E)，介导林可酰胺类耐药的基因lnu(B)以及转座酶tnp。2013年，多重耐药基因lsa(E)首次在欧洲人源MRSA和MSSA中被检出(Wendlandt et al.2013)，同年，Li等人在猪源MRSA中检测到lsa(E)基因，并通过序列分析证实该基因位于多重耐药基因簇中。随后，该基因在多种细菌中被发现，包括：粪肠球菌、屎肠球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、猪丹毒杆菌等。SarahWendlandt等在猪源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的lsa(E)基因进行研究中发现，通过对泰妙菌素和沃尼妙林的MIC检测证实该基因可以介导截短侧耳素耐药，将lsa(E)阳性菌株提取质粒后电击转化金黄色葡萄球菌RN4220后，发现该基因位于41kb的质粒上，并通过序列分析证实该基因位于多重耐药基因簇aadE-spc-lsa(E)-lnu(B)-tnp上，质粒携带lsa(E)耐药基因在菌株间水平传播，耐药问题严重，开始得到人们的关注。

伴随着抗生素的大量使用，细菌的耐药问题日益突出。耐药基因的出现，是导致细菌出现耐药的主要原因，如vanA耐药基因的水平转移，导致耐甲氧西林金黄色葡萄球菌出现万古霉素耐药；mcr-1基因则是导致革兰氏阴性菌出现多粘菌素快速耐药的主要原因。而多重耐药细菌基因的出现，更是会造成细菌出现同时对多种抗生素的耐药。如何快速准确的发现耐药基因对于进一步防范耐药菌株的扩散和加深耐药菌的治疗显得尤为重要。作为两种非常重要的多重耐药基因，目前，相关方法均只能单独进行检测cfr基因或者lsa(E)基因，也尚未建立可同时检测cfr和lsa(E)基因的双重PCR检测技术。本发明申请人在前期也发现了一株耐18种抗生素的多重耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，通过全基因组测序结果分析，显示该菌株同时携带cfr基因和lsa(E)耐药基因，该菌株在国内外为首次报道，而这两种耐药基因是否长期共存于其他细菌或者细菌质粒上有必要进行长期探索。

发明内容

本发明的第一个目的是为了解决现有技术的不足，提供一种同时携带多重耐药基因cfr和lsa(E)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，该细菌为国内外首次报道，是寻求细菌耐药机制的重要材料，可用于筛选新型功能微生物/药物/抗菌材料。

本发明的同时携带多重耐药基因cfr和lsa(E)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，该菌株属于金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，命名为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Sta2868B2，该菌株于2020年5月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号：GDMCC No：61037。

本发明的金黄色葡萄球菌Sta2868B2为典型的β-溶血，还原亚碲酸钾，血浆凝固酶阳性菌株，API STAPH鉴定为金黄色葡萄球菌，符合率为77.7％。其生化特征如下：D-右旋糖、D-果糖、右旋甘露糖、D-麦芽糖、D-乳糖、D-海藻糖、D-甘露醇、硝酸钾、β-萘基磷酸盐、丙酮酸钠、D-蔗二塘、N-乙酰基葡萄糖胺、左旋精氨酸和尿素阳性，具金黄色葡萄球菌典型生理生化特征。参照美国临床实验室标准委员会(Clinical and Laboratory Standardsinstitute，CLSI)2015版规定的抗生素微量稀释法进行耐药鉴定，头孢西丁对金黄色葡萄球菌Sta2868B2最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)为32μg/mL，根据CLSI(2015)的规定，金黄色葡萄球菌对头孢西丁的MIC值≥8μg/mL时，即可判定该菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。同时，金黄色葡萄球菌Sta2868B2经PCR确证，含有mecA基因，也进一步确证该菌株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

进一步地，本发明金黄色葡萄球菌Sta2868B2分别对青霉素类抗生素(青霉素、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、头孢吡肟、头孢他啶)、氨基糖苷类抗生素(庆大霉素、卡那霉素、链霉素)、氯霉素类抗生素(氯霉素、氟苯尼考)、林克酰胺类抗生素(克林霉素)、大环类脂内抗生素(红霉素、泰利菌素)、截短侧耳素类抗生素(泰妙菌素)、喹诺酮类抗生素(环丙沙星、诺氟沙星)、四环素类抗生素(四环素)、恶唑烷酮类抗生素(利奈唑胺)、磺胺类抗生素(复方新诺明)和链阳菌素抗生素(喹努普汀/达福普汀)具有耐药性。

金黄色葡萄球菌Sta2868B2可培养于TSA、BHI和NA培养基中。

本发明的金黄色葡萄球菌Sta2868B2同时携带cfr和lsa(E)两种多重耐药基因，cfr的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，lsa(E)的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。

因此本发明的第二个目的是提供一种能够检测金黄色葡萄球菌Sta2868B2的双重PCR引物，包括用于扩增cfr基因片段的上游引物cfr-F、下游引物cfr-R和lsa(E)基因片段的上游引物lsa(E)-F、下游引物lsa(E)-R，各引物核苷酸序列如下：

上游引物cfr-F：5’-CCCAAGCTTATGAATTTTAATAATAAAACAAGT-3’；

下游引物cfr-R：5’-CCGGAATTCCTATTGGCTATTTTGATAAT-3’；

上游引物lsa(E)-F：5’-TTGTACGGAATGTATGG-3’；

下游引物lsa(E)-R：5’-TTCGCTTCTATTAAGCACTCTT-3’。

本发明的第三个目的是提供一种金黄色葡萄球菌Sta2868B2的检测方法，包括以下步骤：

提取待测样品的基因组DNA，用上述双重PCR引物进行PCR扩增，然后对PCR产物进行电泳或测序，进行结果判定；

当所述双重PCR扩增产物中含有大小为1050bp的条带，则所述待测样品含有cfr耐药基因；

当所述双重PCR扩增产物中含有大小为675bp的条带，则所述待测样品含有lsa(E)耐药基因；

当所述双重PCR扩增产物中同时含有大小为1050bp的条带和675bp的条带，则所述待测样品同时含有cfr和lsa(E)多重耐药基因，则为金黄色葡萄球菌Sta2868B2；

当所述双重PCR扩增产物中不含有大小为1050bp的条带且不含有大小为675bp的条带，则所述待测样品不含有cfr和lsa(E)多重耐药基因。

所述的PCR扩增，其反应体系配置：2×PCR Master Mix 12.5μL，10μmol/L上下游引物cfr-F和cfr-R各0.5-1μL，10μmol/L上下游引物lsa(E)-F和lsa(E)-R各0.5-1μL，待测样品DNA 1μL，然后补充去离子水使反应总体积为25.0μL。

所述的PCR扩增，其反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，47.9℃～54.7℃退火30s，72℃变性90s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保温。

本发明还提供了一种检测金黄色葡萄球菌Sta2868B2的试剂盒，含有上述双重PCR引物和PCR反应试剂。

本发明申请人发现了一株耐18种抗生素的多重耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)-金黄色葡萄球菌Sta2868B2，该菌株中含有携带cfr基因的质粒，且染色体上携带有多重耐药区，其中含有lsa(E)耐药基因，这是首次发现cfr与lsa(E)同时存在于一株MRSA分离株中，该菌株在国内外均未见报道。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明提供了一种同时携带多重耐药基因cfr和lsa(E)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌-金黄色葡萄球菌Sta2868B2。该菌株对11种类型的抗生素特别是利奈唑胺耐药，可做为筛选新型功能微生物/药物/抗菌材料的模型材料，具有良好的应用前景。

本发明提供了一种同时检测多重耐药基因cfr和lsa(E)的引物组及双重PCR检测方法。该方法具有良好的稳定性和特异性，通过对多组引物进行比较后选定的两对最佳引物；通过调整退火温度来进一步提高反应的特异性，本方法对cfr和lsa(E)的检测具有高度特异性，相互之间及与耐药基因无交叉反应，另外还具有较好的重复性；此外，利用本发明可以一次检测两种耐药基因，全部反应在2个小时内完成，省时省力。同时，利用本发明不需要昂贵的荧光PCR仪，也不需要合成昂贵的探针及相应的试剂，检测成本低，操作简便，利于医院和基层部门实验室应用推广。

Staphylococcus aureus Sta2868B2于2020年5月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号：GDMCC No：61037。

附图说明：

图1为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌株的菌落形态图；

图2为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌株的镜检观察形态图；

图3为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌株的API Staph生化鉴定示意图；

图4为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌株的KB法药敏结果，A：AMP(氨苄西林)，AMC(阿莫西林/克拉维酸)，FEP(头孢吡肟)，FOX(头孢西丁)；B：AK(阿米卡星)，P(青霉素)，CAZ(头孢他啶)，CN(庆大霉素)；C：K(卡那霉素),C(氯霉素)，DA(克林霉素)，S(链霉素)；D：CIP(环丙沙星)，NOR(诺氟沙星)，E(红霉素)，TEL(泰利菌素)；E：RD(利福平)，TE(四环素)，SXT(复方新诺明)，LZD(利奈唑胺)；F：TEC(替考拉宁)，FD(夫西地酸)，QD(喹奴普汀/达福普汀)，F(呋喃妥因)；

图5为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌株的mecA基因PCR扩增图；

图6为cfr和lsa(E)引物梯度退火温度PCR扩增后电泳结果。其中孔道上标注的数字代表退火温度。

图7为cfr和lsa(E)的双重PCR检测方法的退火温度优化结果。其中孔道上标注的数字代表退火温度。

图8为cfr和lsa(E)的双重PCR检测方法实际样本中的检测结果。其中M：DL2000DNA Marker；Lane 1-2：cfr+lsa(E)-菌株；Lane 3-7：cfr-lsa(E)+阳性菌株；Lane 8：cfr+lsa(E)+菌株；Lane 9：cfr-lsa(E)-菌株；C：空白对照。

具体实施方式：

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1：

1、菌株的分离、鉴定和培养

金黄色葡萄球菌Sta2868B2分离自中国杭州市某超市品牌的速冻水饺中，对采集的样品同时进行定性和定量检测，检测方法在国标《食品微生物检验》GB 4789.10-2010的基础上略做调整。取样25g(mL)加入225mL生理盐水的无菌均质袋中均质摇匀，制成1:10的样品液，并从中取1mL加入到装有9mL 10％氯化钠胰酪胨大豆肉汤的试管中，制成1:100的样品液，按照上述方法制成1:1000的样品液；每个梯度3个平行，将样品液放置于恒温培养箱中37℃培养48h后，将每个梯度浓度的样品液分别划线于金黄色葡萄球菌显色板培养基上，37℃中培养24-48h。其典型的金黄色葡萄球菌菌落在显色平板上为粉色球型湿润边缘平整(图1)。将目标菌落从NA平板上转接到脑心浸液营养肉汤(BHI)中，于37℃过夜复苏。在无菌条件下将菌液加入终浓度为40％甘油管中，保存于-40℃冰箱，并进行冻干管保存，由此得到菌株Sta2868B2。

纯化后的菌株Sta2868B2进行形态特征、生理生化、血清型以及分子生物学等方面的鉴定。

染色镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下成原型葡萄串状(图2)。

血浆凝固酶实验：接种单菌落至5mLBHI培养液中，于37℃培养18-24h。吸取培养液1mL，加入血浆凝固酶中，于37℃培养。2.5h后，每一小时观察一次是否凝结，若6h后没凝固，培养过夜再观察验证。

API Staph鉴定：从显色平板上刮取粉色单个菌落，用生理盐水制备成浊度适当的细胞悬浮液，使用API Staph生化鉴定试剂条鉴定(图3)。

菌株Sta2868B2为典型的β-溶血，还原亚碲酸钾，血浆凝固酶阳性菌株，API STAPH鉴定为金黄色葡萄球菌，符合率为77.7％。其生化特征如下：D-右旋糖、D-果糖、右旋甘露糖、D-麦芽糖、D-乳糖、D-海藻糖、D-甘露醇、硝酸钾、β-萘基磷酸盐、丙酮酸钠、D-蔗二塘、N-乙酰基葡萄糖胺、左旋精氨酸和尿素阳性，具金黄色葡萄球菌典型生理生化特征。参照美国临床实验室标准委员会(Clinical and Laboratory Standards institute，CLSI)2015版规定的抗生素微量稀释法进行耐药鉴定，头孢西丁对该菌最小抑菌浓度(Minimalinhibitory concentration，MIC)为32μg/mL，根据CLSI(2015)的规定，金黄色葡萄球菌对头孢西丁的MIC值≥8μg/mL时，即可判定该菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。同时，该菌株经PCR确证，含有mecA基因，也进一步确证该菌株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

综合判断菌株Sta2868B2的外观、形态、革兰氏染色及生化反应可鉴定菌株Sta2868B2为金黄色葡萄球菌，命名为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Sta2868B2，该菌株于2020年5月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号：GDMCC No：61037。

2、药敏特征分析

利用梯度稀释法和KB法进行金黄色葡萄球菌菌株Sta2868B2菌株的药敏确证。梯度稀释法以Staphylococcus aureus ATCC29213作为质控菌株，KB法以Staphylococcusaureus ATCC25923作为质控菌株。两种方法均参考按照美国临床实验试标准委员会(CLSI)上的方法和标准进行测定。

梯度稀释法：每组平行操作3次，得出浓度平均值。选择无菌96孔平底微量培养板，在每排第一孔中加入200μL MH肉汤培养基作为阴性对照；在每排第二孔中加入100μL金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌液和100μL MH肉汤培养基作为阳性对照；在每排第3-12各孔中加入MH肉汤培养基100μL，然后于每排第3孔加入待测药物100μL，混合均匀，并取出100μL移至第4孔中，以此类推直至第12孔混匀后吸取100μL弃去，最后于各孔中加入混匀后的本发明金黄色葡萄球菌Sta2868B2(5×10

KB法：菌株(金黄色葡萄球菌Sta2868B2)经NA平板活化后加入生理盐水稀释至终浓度为1×10

选取抗生素阿莫西林克拉维酸、氨苄西林、头孢吡肟、青霉素、头孢他啶、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、氯霉素、克林霉素、红霉素、泰利霉素、环丙沙星、诺氟沙星、四环素、利奈唑胺、利福平、复方新诺明、喹奴普汀/达富普汀、替拉考宁、呋喃妥因、褐霉素、氟苯尼考、肽妙菌素、万古霉素和达托霉素进行药敏确证，其中阿莫西林克拉维酸、氨苄西林、头孢吡肟、青霉素、头孢他啶、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、泰利霉素、环丙沙星、诺氟沙星、四环素、复方新诺明、喹奴普汀/达富普汀、替拉考宁、呋喃妥因和褐霉素采用KB法进行确证(图4)，其余抗生素复用梯度稀释法进行。经实验，本发明的金黄色葡萄球菌Sta2868B2头孢西丁的MIC值为32μg/mL，为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，同时对11种类型的抗生素特别是利奈唑胺耐药。金黄色葡萄球菌Sta2868B2的具体药敏结果如表1所示。

表1耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌株的耐药表型

注：FFC,氟苯尼考；CHL,氯霉素；CLI,克林霉素；TIA,肽妙菌素；LZD,利奈唑胺；ERY,红霉素；FOX,头孢西丁；VAN,万古霉素；RIP,利福平；DAP,达托霉素；AMP,氨苄西林；FEP,头孢吡肟；CAZ,头孢他啶；GEN,庆大霉素；KAN,卡那霉素；STR,链霉素；TEL,泰利霉素；CIP,环丙沙星；NOR,诺氟沙星；TET,四环素；SXT,复方新诺明；QD,奎奴普丁/达福普丁

3、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌株耐药基因的检测

由于金黄色葡萄球菌Sta2868B2对所选的β-酰胺类抗生素均产生耐药，为进一步确证其是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，采用PCR的方法确认金黄色葡萄球菌菌株Sta2868B2是否含有mecA/mecC基因。mecA/mecC基因可编码青霉素结合蛋白2a(PBP2a)，使相关菌株与β-内酰胺类抗生素亲和力极低。当其他PBP被β-内酰胺类抗生素抑制时，PBP2a不被抑制而替代其他PBP，起到催化细胞壁合成的作用，使细菌得以生存。mecA和mecC基因的引物与扩增方法参考先前文献报道。采用单重PCR的方法，引物序列见表2。PCR扩增条件如下：95℃预变性5min；95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸50s，进行35个循环；最后72℃延伸8min。反应体系(25μL)包含：12.5μL 2×DreamTaq mastermix，9.5μL超纯水，40ng模板DNA，0.5μmol/L上、下游引物。5μL的PCR产物上样于2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离(120V，25min)，使用2000bp DNAMarker，其电泳图如5所示。

表2金黄色葡萄球菌mecA/mecC引物及扩增片段

实施例2

根据本发明设计用于检测cfr基因特异性引物和多重耐药基因lsa(E)引物，确定了能同时检测多重耐药基因cfr和lsa(E)的双重PCR引物，包括用于扩增cfr基因片段的上游引物cfr-F、下游引物cfr-R和lsa(E)基因片段的上游引物lsa(E)-F、下游引物lsa(E)-R，各引物核苷酸序列如下：

上游引物cfr-F：5’-CCCAAGCTTATGAATTTTAATAATAAAACAAGT-3’；

下游引物cfr-R：5’-CCGGAATTCCTATTGGCTATTTTGATAAT-3’；

上游引物lsa(E)-F：5’-TTGTACGGAATGTATGG-3’；

下游引物lsa(E)-R：5’-TTCGCTTCTATTAAGCACTCTT-3’。

(1)cfr基因的反应体系配置：2×PCR Master Mix 12.5μL，10μmol/L上下游引物cfr-F和cfr-R各0.5μL，金黄色葡萄球菌Sta2868B2 DNA 1μL，然后加入去离子水补足，使反应总体积为25.0μL。

PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，47.9℃～65.1℃退火30s，72℃延伸90s，进行35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。

(2)lsa(E)基因的反应体系配置：2×PCR Master Mix 12.5μL，10μmol/L上下游引物lsa(E)-F和lsa(E)-R各0.5μL，金黄色葡萄球菌Sta2868B2 DNA 1μL，然后加入去离子水补足，使反应总体积为25.0μL。

PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，47.9℃～65.1℃退火30s，72℃延伸90s，进行35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。

如图6所示，在47.5℃～58.3℃的退火温度内，二者均具有良好的扩增效果，且测序，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌株同时携带这两种多重耐药基因，所述的cfr的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，lsa(E)的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例3

cfr和lsa(E)的双重PCR检测方法的退火温度优化结果：

(1)双重PCR反应体系配置：2×PCR Master Mix 12.5μL，10μmol/L上下游引物cfr-F和cfr-R各0.5-1μL，10μmol/L上下游引物lsa(E)-F和lsa(E)-R各0.5-1μL，金黄色葡萄球菌Sta2868B2 DNA 1μL，然后补充去离子水使反应总体积为25.0μL。

(2)双重PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，47.9℃～63.5℃退火30s，72℃变性90s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保温。

(3)优化结果：退火温度优化结果如图7所示，当退火温度为49.5℃时，二者扩增效果相一致，电泳条带也较亮，所以反应体系中cfr和lsa(E)的最佳退火温度为50℃。

实施例4

利用本发明提供的cfr和lsa(E)的双重PCR引物组及检测方法，包括以下步骤：

(1)双重PCR反应体系配置：2×PCR Master Mix 12.5μL，10μmol/L上下游引物cfr-F和cfr-R各0.5-1μL，10μmol/L上下游引物lsa(E)-F和lsa(E)-R各0.5-1μL，待测样品DNA1μL，然后补充去离子水使反应总体积为25.0μL。

(2)双重PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，47.9℃～54.7℃退火30s，72℃变性90s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保温。

(3)PCR扩增产物检测分析与判定：取8μL PCR扩增产物，在加入0.01％GelRed核酸染料的1.5％琼脂糖凝胶上电泳后，在凝胶成像系统上检测PCR扩增产物后进行结果判定：

若所述双重PCR扩增产物中含有大小为1050bp的条带，则所述待测样品含有cfr耐药基因；

若所述双重PCR扩增产物中含有大小为675bp的条带，则所述待测样品含有lsa(E)耐药基因；

若所述双重PCR扩增产物中同时含有大小为1050bp的条带和675bp的条带，则所述待测样品同时含有cfr和lsa(E)多重耐药基因；

若所述双重PCR扩增产物中不含有大小为1050bp的条带且不含有大小为675bp的条带，则所述待测样品不含有cfr和lsa(E)多重耐药基因。

实施例5

多重耐药基因cfr和lsa(E)的双重PCR检测方法的特异性测定：

分别以cfr阳性菌株、lsa(E)阳性菌株、cfr-lsa(E)阳性菌株和cfr-lsa(E)阴性菌株共9株，按常规方法提取DNA后，以实施例4的方法进行PCR反应和结果判定。所用各细菌的菌株及检测结果如下表3所示，表3中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性；“√”表示结果与已知菌株结果一致。PCR产物电泳结果如图8所示；其中，Lane 1-2为cfr+lsa(E)-菌株；Lane 3-7为cfr-lsa(E)+菌株；Lane 8为cfr+lsa(E)+菌株；Lane 9为cfr-lsa(E)-菌株；M为2000Maker；C为空白对照。

表3本发明多重耐药基因cfr和lsa(E)的双重PCR检测试验结果

由图7可知，双重PCR的结果与实际情况相符，说明本发明引物组和检测方法具有较强的特异性。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)

<120> 一种同时携带耐药基因cfr和lsa(E)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及其检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1050

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌Sta2868B2(Staphylococcus aureus)

<400> 1

atgaatttta ataataaaac aaagtatggt aaaatacagg aatttttaag aagtaataat 60

gagcctgatt atagaataaa acaaataacc aatgcgattt ttaaacaaag aattagtcga 120

tttgaggata tgaaggttct tccaaaatta cttagggagg atttaataaa taattttgga 180

gaaacagttt tgaatatcaa gctcttagca gagcaaaatt cagagcaagt tacgaaagtg 240

ctttttgaag tatcaaagaa tgagagagta gaaacggtaa acatgaagta taaagcaggt 300

tgggagtcat tttgtatatc atcacaatgc ggatgtaatt ttgggtgtaa attttgtgct 360

acaggcgaca ttggattgaa aaaaaaccta actgtagatg agataacaga tcaagtttta 420

tacttccatt tattaggtca tcaaattgat agcatttctt ttatgggaat gggtgaagct 480

ctagccaacc gtcaagtatt tgatgctctt gattcgttta cggatcctaa tttatttgca 540

ttaagtcctc gtagactttc tatatcaacg attggtatta tacctagtat caaaaaaata 600

acccaggaat atcctcaagt aaatcttaca ttttcattac actcacctta tagtgaggaa 660

cgcagcaaat tgatgccaat aaatgataga tacccaatag atgaggtaat gaatatactc 720

gatgaacata taagattaac ttcaaggaaa gtatatatag cttatatcat gttgcctggt 780

gtaaatgatt ctcttgagca tgcaaacgaa gttgttagcc ttcttaaaag tcgctataaa 840

tcagggaagt tatatcatgt aaatttgata cgatacaatc ctacaataag tgcacctgag 900

atgtatggag aagcaaacga agggcaggta gaagcctttt acaaagtttt gaagtctgct 960

ggtatccatg tcacaattag aagtcaattt gggattgata ttgacgctgc ttgtggtcaa 1020

ttatatggta attatcaaaa tagccaatag 1050

<210> 2

<211> 804

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌Sta2868B2(Staphylococcus aureus)

<400> 2

atgttaaaac aaaaagaatt aattgcaaac gttaagaatc ttactgagtc agatgaacga 60

attacagctt gtatgatgta tggatcgttt accaaaggag aaggtgacca atactctgat 120

atagagttct atatattttt gaaagatagt ataacctcga actttgattc atccaactgg 180

ttgtttgacg tagctccgta cttgatgctt tataaaaatg agtacggaac agaggtagtt 240

atttttgata atcttatacg tggggaattt catttccttt ctgaaaaaga tatgaacata 300

atcccctcgt ttaaagattc aggttatatt cctgatacga aggctatgct tatttacgat 360

gaaacagggc aattagaaaa ttatttatca gagataagtg gtgcaagacc aaatagactt 420

actgaagaaa atgctaattt tttgttgtgt aatttctcta atctatggtt gatgggaatc 480

aacgttctaa aaagaggaga atatgctcgt tcattagaac tcttatcaca acttcaaaaa 540

aatacactac aacttatacg tatggcagaa aaaaatgctg ataattggct aaacatgagt 600

aaaaaccttg aaaaagaaat tagccttgaa aattataaaa aatttgcaaa gaccactgct 660

cgattagata aggtagaatt atttgaagcc tataaaaatt ctttgctatt agttatggat 720

ttgcaaagtc accttattga acaatacaac ttaaaagtta cacatgacat tttagaaaga 780

ttgttgaatt acattagtga atag 804