一种同时携带多重耐药基因cfr和lsa(E)的MRSA的用途

摘要

本发明公开了一种同时携带多重耐药基因cfr和lsa(E)的MRSA的用途。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Sta2868B2在筛选功能微生物、药物或抗菌材料中的应用，所述的金黄色葡萄球菌Sta2868B2，保藏号：GDMCC No：61037。本发明提供了一种同时携带多重耐药基因cfr和lsa(E)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌‑金黄色葡萄球菌Sta2868B2。该菌株对11种类型的抗生素特别是利奈唑胺耐药，可做为筛选新型功能微生物/药物/抗菌材料的模型材料，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种同时携带多重耐药基因cfr和lsa(E)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的用途。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种可引起严重的社区和医院获得性疾病(包括皮肤和软组织感染、感染性心内膜炎、坏死性肺炎、危及生命的败血症和中毒性休克综合征)的病原体(Diep et al.,2006)。近年来，金黄色葡萄球菌的耐药问题日益突出。其中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant S.aureus，MRSA)更成为国内外关注的焦点问题。MRSA不仅对β-内酰胺类抗菌药物耐药，而且对临床常用药物如四环素类、氨基糖苷类和大环内酯类等多种抗菌药物均可产生耐药，其发病率和死亡率超过艾滋病、SARS和禽流感(Kluytmans,2010)。2017年2月底，WHO甚至将其列入了全球十二种超级细菌的行列之中。一般来说，金黄色葡萄球菌的耐药性可通过点突变或可移动元件(如质粒、转座子或插入序列元件等)介导的耐药基因的水平转移而出现，而这些耐药基因可来源于同一物种的水平转移或其他相关物种(Ferrero et al.,1995；Gao et al.,2012；Tsiodras et al.,2001；Weigel et al.,2003；Weigel et al.,2007；Yan et al.,2016)。因此，耐药基因的出现，是导致细菌耐药的最主要原因。

在众多的耐药基因中，cfr和lsa(E)比较特殊，都可介导多重耐药。其中，cfr基因是目前发现的唯一一种可同时介导对五种化学结构不同的抗菌药物(酰胺醇类、林可霉素类、截短侧耳素类、恶唑烷酮类和链阳菌素A类)耐药的多重耐药基因，也是迄今为止发现的第一种可介导恶唑烷酮类药物耐药的可转移耐药基因。利奈唑胺(Linezolid)是第一个批准用于治疗由MRSA和VRE(耐万古霉素肠球菌)所引起的感染的恶唑烷酮类药物，近年来效果一直较为显著，而cfr基因的出现大大加速了利奈唑胺耐药性的扩散传播。而lsa(E)基因属于ABC转运基因，编码ABC转运蛋白，能同时介导三类不同化学结构的抗菌药物产生耐药(林克胺类、截短侧耳素类和链阳菌素A类)，这三类抗菌药物均为人医和兽医临床上非常重要的抗感染药物。值得注意的是，lsa(E)基因常存在于多重耐药簇aadE-spc-lsa(E)-lnu(B)-tnp上，该基因簇通常含有多个耐药基因，分别为介导氨基糖苷类抗生素耐药的基因aadE和spc，林可酰胺-截短侧耳素-链阳菌素A类的耐药基因lsa(E)，介导林可酰胺类耐药的基因lnu(B)以及转座酶tnp。

细菌耐药性情况的不断加剧，为抗感染的治疗加深了难度，为了寻求解决办法，致力于研究新型抗耐药菌药物和制剂刻不容缓。我们从环境或临床获得的耐药菌株成为了寻求新的抗菌药物研究实验的必要材料，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、产ESBLs或AmpC酶的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌；多重耐药的铜绿假单胞菌、热带念珠菌等。

发明内容

本发明的第一个目的是为了解决现有技术的不足，提供一种同时携带多重耐药基因cfr和lsa(E)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的用途，该细菌为国内外首次报道，是寻求细菌耐药机制的重要材料，可用于筛选新型功能微生物/药物/抗菌材料。

本发明的同时携带多重耐药基因cfr和lsa(E)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，该菌株属于金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，命名为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Sta2868B2，该菌株于2020年5月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号：GDMCC No：61037。

本发明提供金黄色葡萄球菌Sta2868B2在筛选功能微生物、药物或抗菌材料中的应用。

所述的功能微生物、药物或抗菌材料是抑制金黄色葡萄球菌Sta2868B2的功能微生物、药物或抗菌材料。

所述的功能微生物、药物或抗菌材料是抑制利奈唑胺耐药细菌的功能微生物、药物或抗菌材料。

本发明的金黄色葡萄球菌Sta2868B2为典型的β-溶血，还原亚碲酸钾，血浆凝固酶阳性菌株，API STAPH鉴定为金黄色葡萄球菌，符合率为77.7％。其生化特征如下：D-右旋糖、D-果糖、右旋甘露糖、D-麦芽糖、D-乳糖、D-海藻糖、D-甘露醇、硝酸钾、β-萘基磷酸盐、丙酮酸钠、D-蔗二塘、N-乙酰基葡萄糖胺、左旋精氨酸和尿素阳性，具金黄色葡萄球菌典型生理生化特征。参照美国临床实验室标准委员会(Clinical and Laboratory Standardsinstitute，CLSI)2015版规定的抗生素微量稀释法进行耐药鉴定，头孢西丁对金黄色葡萄球菌Sta2868B2最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)为32μg/mL，根据CLSI(2015)的规定，金黄色葡萄球菌对头孢西丁的MIC值≥8μg/mL时，即可判定该菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。同时，金黄色葡萄球菌Sta2868B2经PCR确证，含有mecA基因，也进一步确证该菌株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

进一步地，本发明金黄色葡萄球菌Sta2868B2分别对青霉素类抗生素(青霉素、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、头孢吡肟、头孢他啶)、氨基糖苷类抗生素(庆大霉素、卡那霉素、链霉素)、氯霉素类抗生素(氯霉素、氟苯尼考)、林克酰胺类抗生素(克林霉素)、大环类脂内抗生素(红霉素、泰利菌素)、截短侧耳素类抗生素(泰妙菌素)、喹诺酮类抗生素(环丙沙星、诺氟沙星)、四环素类抗生素(四环素)、恶唑烷酮类抗生素(利奈唑胺)、磺胺类抗生素(复方新诺明)和链阳菌素抗生素(喹努普汀/达福普汀)具有耐药性。

本发明的金黄色葡萄球菌Sta2868B2同时携带cfr和lsa(E)两种多重耐药基因，cfr的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，lsa(E)的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。

金黄色葡萄球菌Sta2868B2可培养于TSA、BHI和NA培养基中。

本发明申请人发现了一株耐18种抗生素的多重耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)-金黄色葡萄球菌Sta2868B2，该菌株中含有携带cfr基因的质粒，且染色体上携带有多重耐药区，其中含有lsa(E)耐药基因，这是首次发现cfr与lsa(E)同时存在于一株MRSA分离株中，该菌株在国内外均未见报道。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明提供了一种同时携带多重耐药基因cfr和lsa(E)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌-金黄色葡萄球菌Sta2868B2。该菌株对11种类型的抗生素特别是利奈唑胺耐药，可做为筛选新型功能微生物/药物/抗菌材料的模型材料，具有良好的应用前景。

Staphylococcus aureus Sta2868B2于2020年5月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号：GDMCC No：61037。

附图说明：

图1为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌株的菌落形态图；

图2为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌株的镜检观察形态图；

图3为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌株的API Staph生化鉴定示意图；

图4为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌株的KB法药敏结果，A：AMP(氨苄西林)，AMC(阿莫西林/克拉维酸)，FEP(头孢吡肟)，FOX(头孢西丁)；B：AK(阿米卡星)，P(青霉素)，CAZ(头孢他啶)，CN(庆大霉素)；C：K(卡那霉素),C(氯霉素)，DA(克林霉素)，S(链霉素)；D：CIP(环丙沙星)，NOR(诺氟沙星)，E(红霉素)，TEL(泰利菌素)；E：RD(利福平)，TE(四环素)，SXT(复方新诺明)，LZD(利奈唑胺)；F：TEC(替考拉宁)，FD(夫西地酸)，QD(喹奴普汀/达福普汀)，F(呋喃妥因)；

图5为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌株的mecA基因PCR扩增图；

图6为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌株的cfr基因和lsa(E)PCR扩增图；

具体实施方式：

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1：

1、菌株的分离、鉴定和培养

金黄色葡萄球菌Sta2868B2分离自中国杭州市某超市品牌的速冻水饺中，对采集的样品同时进行定性和定量检测，检测方法在国标《食品微生物检验》GB 4789.10-2010的基础上略做调整。取样25g(mL)加入225mL生理盐水的无菌均质袋中均质摇匀，制成1:10的样品液，并从中取1mL加入到装有9mL 10％氯化钠胰酪胨大豆肉汤的试管中，制成1:100的样品液，按照上述方法制成1:1000的样品液；每个梯度3个平行，将样品液放置于恒温培养箱中37℃培养48h后，将每个梯度浓度的样品液分别划线于金黄色葡萄球菌显色板培养基上，37℃中培养24-48h。其典型的金黄色葡萄球菌菌落在显色平板上为粉色球型湿润边缘平整(图1)。将目标菌落从NA平板上转接到脑心浸液营养肉汤(BHI)中，于37℃过夜复苏。在无菌条件下将菌液加入终浓度为40％甘油管中，保存于-40℃冰箱，并进行冻干管保存，由此得到菌株Sta2868B2。

纯化后的菌株Sta2868B2进行形态特征、生理生化、血清型以及分子生物学等方面的鉴定。

染色镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下成原型葡萄串状(图2)。

血浆凝固酶实验：接种单菌落至5mLBHI培养液中，于37℃培养18-24h。吸取培养液1mL，加入血浆凝固酶中，于37℃培养。2.5h后，每一小时观察一次是否凝结，若6h后没凝固，培养过夜再观察验证。

API Staph鉴定：从显色平板上刮取粉色单个菌落，用生理盐水制备成浊度适当的细胞悬浮液，使用API Staph生化鉴定试剂条鉴定(图3)。

菌株Sta2868B2为典型的β-溶血，还原亚碲酸钾，血浆凝固酶阳性菌株，API STAPH鉴定为金黄色葡萄球菌，符合率为77.7％。其生化特征如下：D-右旋糖、D-果糖、右旋甘露糖、D-麦芽糖、D-乳糖、D-海藻糖、D-甘露醇、硝酸钾、β-萘基磷酸盐、丙酮酸钠、D-蔗二塘、N-乙酰基葡萄糖胺、左旋精氨酸和尿素阳性，具金黄色葡萄球菌典型生理生化特征。参照美国临床实验室标准委员会(Clinical and Laboratory Standards institute，CLSI)2015版规定的抗生素微量稀释法进行耐药鉴定，头孢西丁对该菌最小抑菌浓度(Minimalinhibitory concentration，MIC)为32μg/mL，根据CLSI(2015)的规定，金黄色葡萄球菌对头孢西丁的MIC值≥8μg/mL时，即可判定该菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。同时，该菌株经PCR确证，含有mecA基因，也进一步确证该菌株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

综合判断菌株Sta2868B2的外观、形态、革兰氏染色及生化反应可鉴定菌株Sta2868B2为金黄色葡萄球菌，命名为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Sta2868B2，该菌株于2020年5月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号：GDMCC No：61037。

2、药敏特征分析

利用梯度稀释法和KB法进行金黄色葡萄球菌菌株Sta2868B2菌株的药敏确证。梯度稀释法以Staphylococcus aureus ATCC29213作为质控菌株，KB法以Staphylococcusaureus ATCC25923作为质控菌株。两种方法均参考按照美国临床实验试标准委员会(CLSI)上的方法和标准进行测定。

梯度稀释法：每组平行操作3次，得出浓度平均值。选择无菌96孔平底微量培养板，在每排第一孔中加入200μL MH肉汤培养基作为阴性对照；在每排第二孔中加入100μL金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌液和100μL MH肉汤培养基作为阳性对照；在每排第3-12各孔中加入MH肉汤培养基100μL，然后于每排第3孔加入待测药物100μL，混合均匀，并取出100μL移至第4孔中，以此类推直至第12孔混匀后吸取100μL弃去，最后于各孔中加入混匀后的本发明金黄色葡萄球菌Sta2868B2(5×10

KB法：菌株(金黄色葡萄球菌Sta2868B2)经NA平板活化后加入生理盐水稀释至终浓度为1×10

选取抗生素阿莫西林克拉维酸、氨苄西林、头孢吡肟、青霉素、头孢他啶、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、氯霉素、克林霉素、红霉素、泰利霉素、环丙沙星、诺氟沙星、四环素、利奈唑胺、利福平、复方新诺明、喹奴普汀/达富普汀、替拉考宁、呋喃妥因、褐霉素、氟苯尼考、肽妙菌素、万古霉素和达托霉素进行药敏确证，其中阿莫西林克拉维酸、氨苄西林、头孢吡肟、青霉素、头孢他啶、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、泰利霉素、环丙沙星、诺氟沙星、四环素、复方新诺明、喹奴普汀/达富普汀、替拉考宁、呋喃妥因和褐霉素采用KB法进行确证(图4)，其余抗生素复用梯度稀释法进行。经实验，本发明的金黄色葡萄球菌Sta2868B2头孢西丁的MIC值为32μg/mL，为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，同时对11种类型的抗生素特别是利奈唑胺耐药。金黄色葡萄球菌Sta2868B2的具体药敏结果如表1所示。

表1耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌株的耐药表型

注：FFC,氟苯尼考；CHL,氯霉素；CLI,克林霉素；TIA,肽妙菌素；LZD,利奈唑胺；ERY,红霉素；FOX,头孢西丁；VAN,万古霉素；RIP,利福平；DAP,达托霉素；AMP,氨苄西林；FEP,头孢吡肟；CAZ,头孢他啶；GEN,庆大霉素；KAN,卡那霉素；STR,链霉素；TEL,泰利霉素；CIP,环丙沙星；NOR,诺氟沙星；TET,四环素；SXT,复方新诺明；QD,奎奴普丁/达福普丁

3、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌株耐药基因的检测

由于金黄色葡萄球菌Sta2868B2对所选的β-酰胺类抗生素均产生耐药，为进一步确证其是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，采用PCR的方法确认金黄色葡萄球菌菌株Sta2868B2是否含有mecA/mecC基因。mecA/mecC基因可编码青霉素结合蛋白2a(PBP2a)，使相关菌株与β-内酰胺类抗生素亲和力极低。当其他PBP被β-内酰胺类抗生素抑制时，PBP2a不被抑制而替代其他PBP，起到催化细胞壁合成的作用，使细菌得以生存。mecA和mecC基因的引物与扩增方法参考先前文献报道。采用单重PCR的方法，引物序列见表2。PCR扩增条件如下：95℃预变性5min；95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸50s，进行35个循环；最后72℃延伸8min。反应体系(25μl)包含：12.5μL 2×DreamTaq mastermix，9.5μL超纯水，40ng模板DNA，0.5μmol/L上、下游引物。5μl的PCR产物上样于2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离(120V，25min)，使用2000bp DNAMarker(图5)。

表2金黄色葡萄球菌mecA/mecC引物及扩增片段

同时，针对其多重耐药的特性，选取了多重耐药基因cfr和lsa(E)对金黄色葡萄球菌菌株Sta2868B2菌株进行PCR检测。引物与扩增方法参考先前文献报道。所使用的引物由北京六合华大基因科技有限公司合成(引物序列见表3)。反应体系(25μL)包含：12.5μL 2×DreamTaq mastermix，8.5μL超纯水，80ng模板DNA，0.5μmol/L上、下游引物。PCR扩增条件如下：94℃预变性5min；94℃变性45s，65℃[△T-1℃]退火45s，72℃延伸90s，进行15个循环；94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸90s，进行20个循环；最后72℃延伸10min。10μL的PCR产物上样于2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离(120V，40min)，使用2000bp DNA Marker(图6)。

表3多重耐药基因cfr和lsa(E)引物及扩增片段

经实验，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌株同时携带这两种多重耐药基因，所述的cfr的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，lsa(E)的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌株的应用

金黄色葡萄球菌Sta2868B2的具体应用方法主要体现在两个方面：(1)cfr基因可同时对五种化学结构不同的抗菌药物(酰胺醇类、林可霉素类、截短侧耳素类、恶唑烷酮类和链阳菌素A类)产生耐药，特别是属于恶唑烷酮类抗生素的利奈唑胺(Linezolid)，被认为是治疗由MRSA和VRE(耐万古霉素肠球菌)所引起的感染的良药，近年来效果一直较为显著，而cfr基因的出现大大加速了利奈唑胺耐药性的扩散传播。而lsa(E)基因属于ABC转运基因，编码ABC转运蛋白，能同时介导三类不同化学结构的抗菌药物产生耐药(林克胺类、截短侧耳素类和链阳菌素A类)，这三类抗菌药物均为人医和兽医临床上非常重要的抗感染药物。这两种多重耐药基因在同一菌种中的出现，对于探讨MRSA的耐药发生机制，对治疗MRSA感染的新策略的研究具有重要指导意义，可作为寻求细菌耐药机制的重要材料。(2)另一个用途为筛选功能微生物/药物/抗菌材料，筛选方法如下：

1)功能微生物的筛选

于实验前一天取出放置于冰箱-4℃保存的本发明金黄色葡萄球菌Sta2868B2，待放至室温，用接种环分别挑取少量菌落，分别接种于MH琼脂培养基上，在35℃恒温箱中培养18-24h。于新长出菌落的MH琼脂培养基上，用接种环挑取少量活化菌落于已灭菌的干燥试管中，用无菌生理盐水稀释配制成1.5×10

取抑菌效果较好的功能菌接种于相应的培养基上，同前面方法制成原液。将高压灭菌的BHI液体培养基分装到多个三角瓶内，用盐酸和氢氧化钠多次少量加入分装好的BHI液体培养基调节培养基pH值。分别将温度(℃)设置为32、35和37℃，初始pH设置为4、5.5和7，接种量设置为10％、25％和50％，培养时间设置为24、36和48h，进行3水平4因素正交实验。利用正交实验选出的最佳培养条件，培养功能益生菌菌株，以培养原液作为种子液。同时按前面拮抗实验方法，制备本发明金黄色葡萄球菌Sta2868B2稀释菌液，并加入到营养平板涂布均匀后，将灭菌后的牛津杯放置营养平板上，分别向牛津杯内加入培养的功能益生菌菌株种子液200μL，检测益生菌菌株对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用。对照采用BHI培养基，对照菌株种子液制备方法同拮抗初筛实验。

2)药物筛选

精密称取一定量的待测药物，用合适溶媒(如质量浓度为5％的DMSO或质量浓度为5％的DMF)溶解，配制成30mg/mL的溶液待用。再用合适溶媒(如质量浓度为5％的DMSO或质量浓度为5％的DMF)配制成浓度为2000μg/mL的溶液，用来测定其最低抑菌浓度(minimuminhibitory concentration，MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidalconcentration，MBC)，置于冰箱中-4℃保存备用。实验前一天，取出于冰箱-4℃保存的本发明金黄色葡萄球菌Sta2868B2，待放至室温，用接种环分别挑取少量菌落，分别接种于MH琼脂培养基上，在35℃恒温箱中培养18-24h。于新长出菌落的MH琼脂培养基上，用接种环挑取少量活化菌落于已灭菌的干燥试管中，用无菌生理盐水稀释配制成1.5×10

按照美国临床实验试标准委员会(CLSI)上的方法和标准进行测定，实验前一天，待测标准细菌接种于MH琼脂培养基，在35℃恒温箱中培养18-24h，使活化。以合适溶媒为溶剂(如质量浓度为5％的DMSO或质量浓度为5％的DMF)，使待测药物溶解，放置待用。用无菌棉签蘸取已制备好的标准细菌浓度为1.5×10

选取对耐药菌株敏感(抑菌圈直径不小于10mm)的待测药物，根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的微量液基稀释法来测定菌株对不同药物的MIC值，每组平行操作3次，得出浓度平均值。选择无菌96孔平底微量培养板，在每排第一孔中加入200μL MH肉汤培养基作为阴性对照；在每排第二孔中加入100μL本发明金黄色葡萄球菌Sta2868B2菌液和100μL MH肉汤培养基作为阳性对照；在每排第3-12各孔中加入MH肉汤培养基100μL，然后于每排第3孔加入待测药物100μL，混合均匀，并取出100μL移至第4孔中，以此类推直至第12孔混匀后吸取100μL弃去，最后于各孔中加入混匀后的本发明耐药菌(5×10

当确定MIC值后，取MIC值前3-5个孔的细菌和MH肉汤培养基混合物，转种在MH琼脂培养基上，置35℃的培养箱中，培养22h后取出观察，平均数小于5个的最低药物浓度即确定为该化合物的MBC。

3)抗菌材料筛选

抗菌材料取决于选取的抗菌剂，目前，抗菌剂按其化学组成可分为无机系、有机系和复合类三大类。无机系抗菌剂主要可分为重金属类(Au、Ag、Hg、Cu、Zn、Ba、Bi、Ta等金属及其化合物)、光催化类(如TiO2、ZnO、CdS、WO

本发明金黄色葡萄球菌Sta2868B2用于抗菌材料的筛选依据GB15979附录C产品性能、抗菌性能与稳定性测试方法进行。具体方法如下：将本发明金黄色葡萄球菌Sta2868B224 h斜面培养物用PBS洗下，制成菌悬液(要求的浓度为：100μL滴于对照样品上或样液内，回收菌数为1×10

试验重复3次，按式(C1)计算杀菌率:

X＝(A-B)/A×100％..............................(Cl)

式中：X抑菌率，％；A-对照样品平均菌落数；B-被试样品平均菌落数。

对于溶出性抗菌材料，当抑菌率≥50％-90％时，表明该材料具有抑菌作用；当抑菌率＞90％，显示相关材料具较强的抑菌作用。对于非溶出性抗菌材料，不加样片组的菌落数在1×10

抗菌材料的稳定性测试方法为：

1)自然留样：将原样品置室温下至少1年，每半年进行抑菌或杀菌性能测试。

2)加速试验：将原样品置54-57℃恒温箱内14天或37-40℃恒温箱内3个月，保持相对湿度＞75％，进行抑菌或杀菌性能测试。

抗菌材料经自然留样，其杀菌率或抑菌率达到上述规定的标准值，产品的杀菌或抑菌作用在室温下的保持时间即为自然留样时间。

产品经54℃加速试验，其杀菌率或抑菌率达到上述规定的标准值，产品的杀菌或抑菌作用在室温下至少保持一年。

产品经37℃加速试验，其杀菌率或抑菌率达到上述规定的标准值，产品的杀菌或抑菌作用在室温下至少保持二年。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)

<120> 一种同时携带多重耐药基因cfr和lsa(E)的MRSA的用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1050

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌Sta2868B2(Staphylococcus aureus)

<400> 1

atgaatttta ataataaaac aaagtatggt aaaatacagg aatttttaag aagtaataat 60

gagcctgatt atagaataaa acaaataacc aatgcgattt ttaaacaaag aattagtcga 120

tttgaggata tgaaggttct tccaaaatta cttagggagg atttaataaa taattttgga 180

gaaacagttt tgaatatcaa gctcttagca gagcaaaatt cagagcaagt tacgaaagtg 240

ctttttgaag tatcaaagaa tgagagagta gaaacggtaa acatgaagta taaagcaggt 300

tgggagtcat tttgtatatc atcacaatgc ggatgtaatt ttgggtgtaa attttgtgct 360

acaggcgaca ttggattgaa aaaaaaccta actgtagatg agataacaga tcaagtttta 420

tacttccatt tattaggtca tcaaattgat agcatttctt ttatgggaat gggtgaagct 480

ctagccaacc gtcaagtatt tgatgctctt gattcgttta cggatcctaa tttatttgca 540

ttaagtcctc gtagactttc tatatcaacg attggtatta tacctagtat caaaaaaata 600

acccaggaat atcctcaagt aaatcttaca ttttcattac actcacctta tagtgaggaa 660

cgcagcaaat tgatgccaat aaatgataga tacccaatag atgaggtaat gaatatactc 720

gatgaacata taagattaac ttcaaggaaa gtatatatag cttatatcat gttgcctggt 780

gtaaatgatt ctcttgagca tgcaaacgaa gttgttagcc ttcttaaaag tcgctataaa 840

tcagggaagt tatatcatgt aaatttgata cgatacaatc ctacaataag tgcacctgag 900

atgtatggag aagcaaacga agggcaggta gaagcctttt acaaagtttt gaagtctgct 960

ggtatccatg tcacaattag aagtcaattt gggattgata ttgacgctgc ttgtggtcaa 1020

ttatatggta attatcaaaa tagccaatag 1050

<210> 2

<211> 804

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌Sta2868B2(Staphylococcus aureus)

<400> 2

atgttaaaac aaaaagaatt aattgcaaac gttaagaatc ttactgagtc agatgaacga 60

attacagctt gtatgatgta tggatcgttt accaaaggag aaggtgacca atactctgat 120

atagagttct atatattttt gaaagatagt ataacctcga actttgattc atccaactgg 180

ttgtttgacg tagctccgta cttgatgctt tataaaaatg agtacggaac agaggtagtt 240

atttttgata atcttatacg tggggaattt catttccttt ctgaaaaaga tatgaacata 300

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gaaacagggc aattagaaaa ttatttatca gagataagtg gtgcaagacc aaatagactt 420

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aatacactac aacttatacg tatggcagaa aaaaatgctg ataattggct aaacatgagt 600

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cgattagata aggtagaatt atttgaagcc tataaaaatt ctttgctatt agttatggat 720

ttgcaaagtc accttattga acaatacaac ttaaaagtta cacatgacat tttagaaaga 780

ttgttgaatt acattagtga atag 804