一种用于氨苄青霉素检测的电化学适配体传感器

摘要

本发明提供了一种用于氨苄青霉素检测的电化学适配体传感器，包括检测电极，血红素，序列如SEQ ID NO:3‑6所示的H3链、H4链、适配体Apt、T链；所述检测电极为表面修饰H1链和H2链的金电极，所述H1链和H2链序列如SEQ ID NO:1‑2所示，所述H1链的5’端和所述H2链的3’端修饰巯基。该传感器通过T链的循环和电极上的DNA步行器的方式来实现信号的增大，大大提高了检测灵敏度并获得较低的检测下限，可用于检测食品中痕量的氨苄青霉素。

说明书

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种用于氨苄青霉素的检测的电化学适配体传感器。

背景技术

氨苄青霉素（AMP）是一种β-内酰胺抗生素，属于青霉素类，是最常用的一类抗生素。氨苄青霉素能够抑制细菌壁合成，被广泛应用于人类和兽医的治疗中， 可以预防和治疗由链球菌和葡萄球菌等细菌感染引起的胃肠道、呼吸道、皮肤和泌尿生殖细菌感染。然而，过度使用氨苄青霉素或氨苄青霉素在食品或环境中的残留会导致严重的食品安全和环境安全问题，引起人体的过敏反应和癫痫等症状。建立高效、可靠的检测方法具有重要意义，高效液相色谱（HPLC）、酶联免疫法（ELSSA）、毛细管电泳法（CE）、气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）等常规分析技术已广泛应用于氨苄青霉素的定量分析。这些方法虽然灵敏、准确，但大多需要精密仪器、复杂的样品预处理和熟练的技术人员，不适合现场监测。因此，迫切需要设计一种操作简单、灵敏度高、成本低的无设备检测策略。

发明内容

为了解决现有技术检测氨苄青霉素方法的特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的氨苄青霉素电化学传感器，通过T链的循环和电极上的DNA步行器的方式来实现信号的增大，大大提高了检测灵敏度并获得较低的检测下限，可用于检测食品中痕量的氨苄青霉素。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种用于氨苄青霉素检测的电化学适配体传感器，包括检测电极，血红素，序列如SEQ ID NO: 3-6所示的H3链、H4链、适配体Apt、T链；所述检测电极为表面修饰H1链和H2链的金电极，所述H1链和H2链序列如SEQ ID NO: 1-2所示，所述H1链的5’端和所述H2链的3’端修饰巯基。

优选的，所述H1链与H2链的摩尔比为1:1-15；所述H3链与H4链的摩尔比为1:1-15；所述H1链与所述H3链的摩尔比为1:1。

一种利用上述电化学适配体传感器检测氨苄青霉素的方法，包括以下步骤：

（1）将H1链和H2链依次修饰到金电极表面，获得H1-H2修饰金电极；

（2）适配体Apt和T链在缓冲溶液杂交获得Apt-T杂交链；

（3）将Apt-T杂交链、氨苄青霉素的待测液或系列浓度标准溶液混合，再加入含H3链和H4链的溶液孵育，获得反应液；

（4）H1-H2修饰金电极表面滴加反应液反应，冲洗后再滴加血红素孵育；然后以双氧水为底物，以Ag/AgCl电极为参比电极、Pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法（DPV）检测信号；

（5）以系列浓度标准溶液中氨苄青霉素浓度对数对电流大小作标准曲线，根据待测液电流大小计算待测液中氨苄青霉素浓度。

优选的，步骤（1）中修饰前还包括金电极预处理步骤：在0.3和0.05 µM氧化铝液浆中依次抛光，然后冲洗。

步骤（1）中，修饰步骤为将含H1链或H2链的溶液滴加到电极表面，在37 ℃下反应30 min后冲洗。

步骤（2）中，杂交步骤为将含适配体Apt和T链的溶液在95 ℃下变性5 min，然后自然冷至室温。

步骤（2）中，所述缓冲溶液为pH 7.4的PBS缓冲液；优选的，为含有1 mM MgCl

优选的，步骤（4）中，反应的温度为37 ℃，反应时间为60min。

优选的，步骤（4）中，差分脉冲伏安法参数设置为：电位0到-0.5 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06 s。

本发明的检测原理如下：

本发明的传感器共用到了6条DNA链，其序列（5’-3’）如下：

Apt: GCGGGCGGTTGTATAGCGG

T: CCGCTACCGCCC

H1: SH-TTTTT

H2:

H3: CACACAGTGGTG TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CACCACTGTGTGGTGTGCCGCTAC

H4: GGGTAGGGCGGGTTGGG GCTGGCCCTAC GTCAG CACACAGTG

其中，Apt为氨苄青霉素的适配体，T与Apt部分相互杂交，形成弓形探针，当氨苄青霉素存在时，氨苄青霉素与适配体结合，使弓形探针解链，释放T链，H1、H2、H3、H4均为发夹结构，H1与H2中下划线斜体部分分别为DNA Toe 1-4，T链可以与H1的Toe 1杂交，打开发夹H1，H3可以与H1的Toe 2杂交，引发催化发夹组装（CHA）反应，诱导形成二段式DNA步行器；H3的5’端可以与H2的Toe 3杂交，打开发夹H2，H4可以与H2的Toe 4杂交，同样引发催化发夹组装反应，使得H4结合在电极表面，G-四联体（加黑部分）靠近电极。H1的5’端以及H2的3’端修饰了巯基（-SH），能够通过与金电极形成金硫键（Au-S），从而固定在电极表面。

如图1所示，当氨苄青霉素不存在时，Apt-T保持结合状态，后续二段式DNA步行器将不会被组装。当氨苄青霉素存在时，Apt-T弓形探针被打开，释放出T链，T链借助Toe 1与发夹H1结合，打开发夹H1，暴露出Toe 2，H3借助Toe 3与H1结合，诱导形成二段式DNA步行器，同时释放出H3的5’末端，H3的5’端行走于电极表面，借助H2中的Toe 3打开H2，同时暴露出H2中的Toe 4，使得H4发夹借助Toe 4与H2杂交，同时暴露出H4位于3’端的G-四联体序列，在Hemin存在时，形成G-四联体DNAzyme结构，此结构有类过氧化物酶活性，可以催化H

本发明具有以下优点：

本发明的传感器利用氨苄青霉素与适配体的特异性识别实现了对目标物氨苄青霉素的高特异性检测；利用T链的循环和电极上的DNA步行器，实现了信号增强的作用，提高了检测的灵敏度；该传感器的反应条件温和，反应速度快；由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用；检测原理的主要过程均是在电极上实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于痕量氨苄青霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用；无需修饰、无酶、依靠熵驱动，制作工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明

图1为本发明传感器的原理图；

图2为Apt-T杂交链浓度优化检测结果图；

图3为H1链和H2链摩尔比优化检测结果图；

图4为孵育时间优化检测结果图；

图5为传感器检测氨苄青霉素的工作曲线；

图6为传感器检测氨苄青霉素的标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。如无特别说明，实施例中PBS缓冲液pH为7.4，含有1 mM MgCl

实施例1 Apt-T杂交链的制备

分别将2 μL的100 μM适配体Apt，2 μL的100 μM的T链，2 μL 5×PBS缓冲液，4 μLddH

实施例2 Apt-T杂交链浓度筛选

（1）金电极依次在0.3 µM和0.05 µM的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，再依次用PBS缓冲液和ddH

（2）将2μM H1链10 μL溶液滴加到步骤（1）获得的金电极表面，在37 ℃下孵育2 h，PBS缓冲液冲洗3次，获得H1修饰的金电极；再将30μM H2链10 μL滴加到H1修饰的金电极表面，在37 ℃下孵育2 h，PBS缓冲液冲洗3次，获得H1-H2修饰金电极；

（3）将0 μL，0.25 μL，0.5 μL，1 μL，2 μL，4 μL实施例1获得Apt-T杂交链溶液分别加入10 nM氨苄青霉素1μL、20 μM的H3链溶液1 μL和100 μM的H4链溶液3 μL，加ddH

（4）H1-H2修饰金电极表面滴加10 μL反应液37 ℃下反应1 h，PBS缓冲液冲洗3次，再滴加50 μM的血红素10 μL于37 ℃下孵育30 min；

（5）将步骤（4）处理后获得的金电极为工作电极，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，在20 mL含5 mM H

结果见图2，从图中可以看出，检测到的电流信号随着Apt-T杂交链的终浓度在0-2μM区间内增大而增大，当终浓度超过2 μM后，电流趋于稳定，所以Apt-T的最佳终浓度为2 μM。

实施例3 H1链和H2链摩尔比筛选

（1）金电极依次在0.3 µM和0.05 µM的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，再依次用PBS缓冲液和ddH

（2）将2 μM H1链10 μL溶液滴加到步骤（1）获得的金电极表面，在37 ℃下孵育2h，PBS缓冲液冲洗3次，获得H1修饰的金电极；再分别将2 μM，10 μM，20 μM，30 μM，40 μM，50μM的H2链10 μL滴加到H1修饰的金电极表面，在37 ℃下孵育2 h，PBS缓冲液冲洗3次，获得H1-H2修饰金电极；

（3）将1 μL实施例1获得Apt-T杂交链溶液，10 nM氨苄青霉素1 μL，20 μM H3链溶液1 μL和100 μM的H4链溶液5 μL，加ddH

（4）H1-H2修饰金电极表面滴加10 μL反应液37 ℃下反应1 h，PBS缓冲液冲洗3次，再滴加50 μM的血红素10 μL于37 ℃下孵育30 min；

（5）将步骤（4）处理后获得的金电极为工作电极，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，在20 mL含5 mM H

结果见图3，从图中可以看出，检测到的电流信号随着H3/H4的大小在1:1-1:15区间内增大而增大，当比值超过1:15后，电流稍有降低，所以H1/H2的最佳摩尔比为1:15。

实施例4 孵育时间筛选

（1）金电极依次在0.3 µM和0.05 µM的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，再依次用PBS缓冲液和ddH

（2）将2μM H1链10 μL溶液滴加到步骤（1）获得的金电极表面，在37 ℃下孵育2 h，PBS缓冲液冲洗3次，获得H1修饰的金电极；再将30μM H2链10 μL滴加到H1修饰的金电极表面，在37 ℃下孵育2 h，PBS缓冲液冲洗3次，获得H1-H2修饰金电极；

（3）将1 μL实施例1获得Apt-T杂交链溶液，10 nM氨苄青霉素1μL，20 μM的H3链溶液1 μL和100 μM的H4链溶液3 μL，加ddH

（4）H1-H2修饰金电极表面滴加10 μL反应液37 ℃下反应0，20 min，40 min，60min，80 min，100 min，然后用PBS缓冲液冲洗3次，再滴加50 μM的血红素10 μL于37 ℃下孵育30 min；

（5）将步骤（4）处理后获得的金电极为工作电极，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，在20 mL含5 mM H

结果见图4，从图中可以看出，检测到的电流信号随步骤（4）的反应时间在0-60min区间内增大而增大，当孵育时间超过60 min后，电流基本不变，所以反应液在金电极表面最佳反应时间为60 min。

实施例5 传感器对氨苄青霉素的检测

（1）金电极依次在0.3 µM和0.05 µM的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，再依次用PBS缓冲液和ddH

（2）将2μM H1链10 μL溶液滴加到步骤（1）获得的金电极表面，在37 ℃下孵育2 h，PBS缓冲液冲洗3次，获得H1修饰的金电极；再将30μM H2链10 μL滴加到H1修饰的金电极表面，在37 ℃下孵育2 h，PBS缓冲液冲洗3次，获得H1-H2修饰金电极；

（3）将1 μL实施例1获得Apt-T杂交链溶液分别与1 pM-10 μM氨苄青霉素1μL，20 μM的H3链溶液1 μL和100 μM的H4链溶液3 μL，加ddH

（4）H1-H2修饰金电极表面滴加10 μL反应液37 ℃下反应1 h，然后用PBS缓冲液冲洗3次，再滴加50 μM的血红素10 μL于37 ℃下孵育30 min；

（5）将步骤（4）处理后获得的金电极为工作电极，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，在20 mL含5 mM H

结果见图5，从图中可以看出，检测到的电流信号随着氨苄青霉素浓度在1 pM-10μM区间内增大而降低。以系列浓度标准溶液中氨苄青霉素浓度对数对电流大小作标准曲线，如图6所示，其拟合曲线为y = 0.53611+ 0.63755x，相关系数0.9953。同时，在1 pM的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于0.8 pM时，氨苄青霉素浓度的对数与电流峰值大小恰好不再符合拟合曲线规律。因此，可得到该方法检测下限为0.8 pM。

序列表

<110> 济南大学

<120> 一种用于氨苄青霉素检测的电化学适配体传感器

<130> 20201112

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> H1

<400> 1

tttttgcggt agcggcacac cacacagtgc cgcta 35

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> H2

<400> 2

caccactgtg tgctgacgta gggccagcac acttt 35

<210> 3

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> H4

<400> 3

cacacagtgg tgtttttttt tttttttttt tttttttttt ttcaccactg tgtggtgtgc 60

cgctac 66

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> H4

<400> 4

gggtagggcg ggttggggct ggccctacgt cagcacacag tg 42

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Apt

<400> 5

gcgggcggtt gtatagcgg 19

<210> 6

<211> 12

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> T链

<400> 6

ccgctaccgc cc 12