强化表达yvbW基因在提高解淀粉芽胞杆菌吲哚乙酸产量中的应用

摘要

本发明属于基因工程领域，具体公开了强化表达yvbW基因在提高解淀粉芽胞杆菌吲哚乙酸产量中的应用，本发明通过基因工程方法在解淀粉芽胞杆菌LX‑12中强化表达了

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及强化表达yvbW基因在提高解淀粉芽胞杆菌吲哚乙酸产量中的应用，通过强化表达氨基酸通透酶YvbW，提高了解淀粉芽胞杆菌吲哚乙酸产量，这为解淀粉芽胞杆菌高产吲哚乙酸提供了一种新策略。

背景技术

解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)具有广泛抗菌能力，在种植、养殖、病害防治、环保等方面具有广泛的应用前景。作为一种良好的益生菌，广泛应用于动植物病原真菌和细菌的防治；作为生物农药，具有日趋取代传统化学农药的趋势。

吲哚乙酸(IAA)是一种植物体内普遍存在的内源生长素，属吲哚类化合物，在高等植物中，它主要存在于生长旺盛的部位，如胚芽鞘、根尖、受精后的子房和幼嫩的种子等。虽然在植物体内含量甚微，但参与了许多生理生化过程的调节与控制，具有十分广泛的生理作用。在适当浓度范围内，IAA可以刺激根毛形成，同时提高横向和初生根的数目和长度，增强植物根系对营养的吸收。近年来，IAA被发现与植物的抗逆性有密切联系，IAA能通过对土壤内重金属的吸收和富集，使重金属对植物的毒害减小，从而起到保护植物的作用。

yvbW已被证实转录为一个单顺反子mRNA，其中包含一个典型的T-box抗终止先导。YvbW被注释为一个假设的氨基酸通透酶，之前的研究中，Cai等人通过强化表达YvbW，提高了胞内支链氨基酸的浓度，进而提高了环肽类抗生素——杆菌肽合成水平。然而，YvbW是否会影响，以及如何影响吲哚乙酸的合成目前尚不清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供强化表达yvbW基因在提高解淀粉芽胞杆菌吲哚乙酸产量中的应用，所述的yvbW基因为SEQ ID NO.1所示。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

强化表达yvbW基因在提高解淀粉芽胞杆菌吲哚乙酸产量中的应用，包括利用本发明的常规技术，在解淀粉芽胞杆菌中强化表达yvbW基因，强化表达yvbW基因后的菌株可用于吲哚乙酸的发酵生产；所述的yvbW基因为SEQ ID NO.1所示。

以上所述的应用中，优选的，所述的解淀粉芽胞杆菌为代谢产物中有吲哚乙酸的菌株；

以上所述的应用中，优选的，所述的解淀粉芽胞杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2015234。

以上所述的应用中，应用过程中涉及到的菌株的制备方法包括：

(1)以地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA为模板，PCR扩增出yvbW基因片段；

(2)通过重叠延伸PCR将P43启动子、yvbW基因和淀粉酶终止子连接到一起，构成目的基因表达框，该目的基因表达框的排列顺序为：P43启动子-yvbW基因-淀粉酶终止子；

(3)采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切片段；

(4)准备质粒pHY-300，并采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒pHY-300进行双酶切，得到线性质粒片段；

(5)将步骤(3)得到的酶切片段和步骤(4)得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到游离表达质粒pHY-yvbW；

(6)将游离表达质粒pHY-yvbW转入大肠杆菌DH5α中，以四环素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，并进行菌落PCR验证，抽取验证成功的阳性转化子的质粒电转化到解淀粉芽胞杆菌LX-12中，以四环素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，进行菌落PCR检测，得到强化表达yvbW基因的解淀粉芽胞杆菌LX-12/pHY-yvbW菌株。

以上所述的方案中，优选的，在应用过程中以强化表达了yvbW基因的解淀粉芽胞杆菌菌株发酵生产吲哚乙酸时，其发酵培养基配方为：15-25g/L葡萄糖；4-6g/L L-谷氨酸钠；0.5-1g/L L-色氨酸；0.5-1.5g/L酵母提取物；0.5-1.5g/L KH

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

与解淀粉芽胞杆菌LX-12相比，通过本发明构建得到的解淀粉芽胞杆菌LX-12/pHY-yvbW的吲哚乙酸产量提高了39％以上。本发明的研究结果表明：强化表达地衣芽胞杆菌DW2中的yvbW基因为提高解淀粉芽胞杆菌LX-12吲哚乙酸产量提供了一种新方法。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

yvbW基因强化表达的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LX-12/pHY-yvbW的获得：

所述yvbW基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

(1)根据地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA序列中yvbW基因序列，设计yvbW基因上游引物(yvbW-F)和下游引物(yvbW-R)；并以地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA为模板，分别以yvbW基因上游引物、下游引物进行PCR扩增，得到yvbW基因片段(1368bp)；

其中，yvbW-F和yvbW-R序列为：

yvbW-F：TAAGAGAGGAATGTACACATGGAGAAAGACATGCAG；

yvbW-R：TCCGTCCTCTCTGCTCTTTTAAGAAGCGGACGTTTG；

再以解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA为模板，PCR分别扩增得到P43启动子(所用引物为P43-F和P43-R)和淀粉酶终止子(所用引物为TamyL-F和TamyL-R)；

其中，P43-F、P43-R、TamyL-F、TamyL-R的序列为：

P43-F：GGTCTAGATGATAGGTGGTATGTTTT

P43-R：CTGCATGTCTTTCTCCATGTGTACATTCCTCTCTTA

TamyL-F：CAAACGTCCGCTTCTTAAAAGAGCAGAGAGGACGGA

TamyL-R：GGGAGCTCCGCAATAATGCCGTCGCA

(2)通过重叠延伸PCR将P43启动子、yvbW基因和淀粉酶终止子连接到一起(所用引物为P43-F和TamyL-R)，得到yvbW基因片段上游连接有P43启动子、同时下游连接有淀粉酶终止子的基因表达框，此片段即为完整的yvbW表达框(2169bp)，排列顺序为：P43启动子-yvbW基因-淀粉酶终止子；

(3)采用XbaI和SacI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切，得到酶切片段(2167bp)；

(4)准备质粒pHY-300，并采用XbaI和SacI限制性内切酶对质粒pHY-300进行双酶切(此构建方法参考下述文献：郭兴华，熊占等(1991)枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建.生物工程学报7(3):224-229和彭清忠,张惟材等(2002)短短小芽胞杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建.生物工程学报18(4):438-441)，得到线性质粒片段(4250bp)。其中，所述的限制性内切酶XbaI和SacI限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；

(5)将步骤(3)得到的酶切片段和步骤(4)得到的线性质粒片段经DNA连接酶(市售的DNA连接酶均可，通常为T4 DNA连接酶)进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有四环素抗性的培养基进行筛选，得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：pHY-F和pHY-R)。若转化子的PCR验证结果为：在2496bp处出现电泳条带，说明YvbW表达载体构建成功，上述转化子即为阳性转化子(命名为：YvbW游离表达载体pHY-yvbW)；

其中，pHY-F和pHY-R的序列为:

pHY-F：GTTTATTATCCATACCCTTAC、

pHY-R：CAGATTTCGTGATGCTTGTC；

(6)将YvbW游离表达载体pHY-yvbW电转化到解淀粉芽胞杆菌LX-12中，37℃条件下在含有四环素抗性的培养基中进行筛选，得到转化子，对转化子进行菌落PCR验证(所用引物为：pHY-F和pHY-R)。若转化子PCR验证结果为：在2496bp处出现电泳条带，证明游离表达载体pHY-yvbW成功转入解淀粉芽胞杆菌LX-12中，此时，该转化子为阳性转化子，即转入了YvbW表达载体pHY-yvbW的解淀粉芽胞杆菌LX-12/pHY-yvbW。

实施例2：

yvbW基因强化表达的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LX-12/pHY-yvbW在高产吲哚乙酸中的应用：

本实施例所用的发酵培养基如下，除表1所示的组分外，每组培养基均含有1g/LKH

表1发酵培养基配方

其中，上述实施例中均采用本发明方法构建得到的解淀粉芽胞杆菌LX-12/pHY-yvbW，以及转入pHY-300空质粒的解淀粉芽胞杆菌对照菌株LX-12/pHY-300；

种子发酵的具体步骤为：先将解淀粉芽胞杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1％接种于装有5mL LB液体培养基中，230r/min、温度37℃，培养12小时。然后将活化后的菌液以体积百分比(1％)接种于种子发酵培养基，并于230r/min、37℃培养12小时，得到种子液(此处所用的种子发酵培养基配方是LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉，10g/L NaCl，pH7.20))。

吲哚乙酸发酵的具体步骤为：向250mL三角瓶中装入50mL的发酵培养基，然后将种子液以接种量为2％(体积百分比)接入发酵培养基中，发酵培养转速120r/min，温度30℃，发酵培养72小时，得到发酵液。

采用高效液相色谱(HPLC)方法对上述实施例中发酵液中吲哚乙酸产量进行测定。测定条件具体为：使用Agilent 1260液相色谱仪检测；色谱柱为Hypersil BDS C18(5μm,4.6mm×250mm)；流动相为A:B＝50:50(A相：甲醇；B相：0.8％冰乙酸溶液)；流速：1.0mL/min；柱温30℃；紫外检测器波长：221nm；进样量20μL。根据吲哚乙酸标准品制作的标准曲线计算出发酵液中吲哚乙酸产量(见表2)。

表2不同菌株吲哚乙酸产量

从表2可看出，在相同种子培养和发酵生产条件下，相对于现有技术的解淀粉芽胞杆菌LX-12/pHY-300来说，本发明所述的强化YvbW表达解淀粉芽胞杆菌LX-12/pHY-yvbW的发酵液中吲哚乙酸含量有了大幅提升(提高39％以上)，说明本发明的技术方案在提高解淀粉芽胞杆菌吲哚乙酸产量方面具有重大应用价值。

序列表

<120> 强化表达yvbW基因在提高解淀粉芽胞杆菌吲哚乙酸产量中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1368

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagaaag acatgcagaa gctcgagcgc acaatgacat cgcggcatat tatgatgatg 60

gcattgggcg gagccattgg agcaggatta tttaaaggaa gcagcaaagc gatcgatttg 120

gcggggcctt cggtcatgat cgcctacttg atcggcggcg tgattttgct gtttatcatg 180

caggggcttg ccgagatggc tgtccgaaac agtgaagcca gaacattcag ggatcttgtt 240

caatcaatat tagggccgta tgccgcttat tttttagact ggatatactg gaaaatgtgg 300

gttctcaata ttgcggcaga ggctgttgtc gccgcgatat ttttgcagta ctggctgccg 360

gggctgccga tctgggtgct ggcgctgttc gtttcactcg tcattacgag cgtgaatttg 420

ctttctgtca aaagctttgc cgagacggaa tactggcttg cccttattaa aatcacagtg 480

attgtcgtct ttattatatc cggatttatc ttgttatttt tctcttttgg acaacactca 540

gctgttggtt ttactcattt gacagaccat ggcggcttct tcccgaatgg cgccggaggg 600

ctgattacag ccatgctagt tgtgatctat tcctatggcg gaaccgaaat tatcggggtg 660

acactggcgg aaaccaaaaa ccctgagaag gtcgtgccta aagccgtgcg tggaacgttg 720

acgcgcatta ttgcttttta tcttctgccg tttttcgtga tcgtcagctt gattccatgg 780

aatcaagtca acggtgtgtc ggagagtcct tttgttatgg tctttaagat gatcggcatt 840

cccggagcgg atcatttgat gaatgcggtc attttactgg cggtcatttc ttcgatgaac 900

tcagggcttt acggcgcctc ccgaataatg tatacacagg catcagacgg aagaatgccg 960

aaaatctttt cgagactttc cgtgagaaaa gtgccggttt attcgattct attatgtact 1020

tctttcttat acttgggcgt attgttttca ctgtttgccg gcagccaaac gtttgaatat 1080

ttgatggggt ctctcggcta taccgtcctt gtgatctgga tgctgattgc cgctgcccat 1140

ttaaaatcga ggaaacggaa tcaaacagcg gggaacggct actatgtcaa atggttccct 1200

tatacgactt ggctggcaat catttcactg acagcgatac tgatcggtgt catcctgacc 1260

acatcgattg tcattacatt ggtgacggcg ggaatctatc tgctcattag cgctgcttat 1320

ttctttaaag gaaggaacca gacagccggc caaacgtccg cttcttaa 1368

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taagagagga atgtacacat ggagaaagac atgcag 36

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tccgtcctct ctgctctttt aagaagcgga cgtttg 36

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtctagatg ataggtggta tgtttt 26

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgcatgtct ttctccatgt gtacattcct ctctta 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caaacgtccg cttcttaaaa gagcagagag gacgga 36

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggagctccg caataatgcc gtcgca 26

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtttattatc cataccctta c 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagatttcgt gatgcttgtc 20