一种油菜耐旱性负调控基因及其应用

摘要

本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及一种油菜耐旱性负调控基因及其应用。所述基因为BnNAC038基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明提供的油菜耐旱性负调控基因BnNAC038在抗旱上起负调控作用，转基因植物中其过量表达会抑制编码参与非生物胁迫诱导的渗透或氧化损伤的响应基因表达，使转基因植物抗旱能力降低，为后续培育耐旱转基因作物提供理论依据和相关基因。

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及一种油菜耐旱性负调控基因及其应用。

背景技术

甘蓝型油菜作为我国重要的油料作物，是菜籽油生产上的主要栽培种。甘蓝型油菜是异源二倍体，源于甘蓝和芜菁的杂交，具有油料价值、饲料价值和观赏价值。近几年，油菜的种植面积逐年上升，但是油菜的抗逆性较差，频繁发生的干旱、低温等极端天气严重影响了油菜的产量。尤其在未来几年，随着全球变暖问题的严峻，大气中的含水量逐渐上升，土壤中含水量减少，会出现高频率的干旱胁迫。因此通过生物学，遗传学和基因工程等方法，培育出抗旱抗盐碱的油菜新品种，是我们科研人员努力的方向。

植物在与胁迫环境相适应的长期进化过程中，形成了抵御各种逆境的生物学机制。其中转录因子与其相应的顺式调节序列充当基因的分子开关，控制基因的表达，从而对植物的抗逆能力进行调节，这是植物抵抗逆境的一种重要方式。NAC转录因子家族是植物特有的一大类转录因子，其N端含有一段保守的NAC结构域，根据其氨基酸序列的相似性被划分为18个亚家族。NAC家族蛋白的N端约有保守的150个氨基酸行使DNA结合功能，C端具有转录抑制或激活活性，为保守型较低的转录调控区。研究表明，NAC基因在多种植物中都能响应干旱和盐碱等非生物胁迫，提高植物的抗逆性和产量。在水稻中过表达拟南芥SNAC1基因能够使其产量在干旱胁迫下增加21％-34％。NAC转录因子TaNAC69在小麦中的表达受到干旱、盐胁迫的诱导，其单株产量在控制水分条件下明显高于野生型。通过系统发育树分析表明，BnNAC038与拟南芥中AtNAC081的蛋白序列相似度很高，说明AtNAC081是BnNAC038在拟南芥中的同源基因。

NAC转录因子家族在植物抵抗各种非生物胁迫中具有重要的作用，但是，人们对于NAC转录因子在油菜中响应非生物胁迫的功能和作用还不够了解。BnNAC038基因属于NAC家族成员之一，通过克隆油菜BnNAC038基因并对其在油菜干旱胁迫条件下发挥的潜在作用进行研究，并解析其具体功能，对于培育优良的抗逆油菜品种具有重要的理论意义和优良价值。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种油菜耐旱性负调控基因，所述基因为BnNAC038，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的目的之二是提供一种油菜耐旱性负调控蛋白，所述蛋白为BnNAC038，由所述的BnNAC038基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的目的之三是提供一种含有所述基因的过表达载体。

本发明的目的之四是提供一种含有所述基因的细胞系。

本发明的目的之五是提供一种含有所述基因的宿主菌。

本发明的目的之六是提供所述基因在转化双子叶植物以产生抗旱能力降低的双子叶植物中的应用。

本发明的目的之七是提供含有所述基因的植物的制备方法，通过促进目的植物中所述基因的表达、增加目的植物中所述蛋白的活性或增加目的植物中所述蛋白的含量，得到转基因植物；所述转基因植物的抗旱性低于所述目的植物。

进一步的，所述的植物的制备方法是通过向目的植物中导入所述基因实现促进所述基因的表达和所述蛋白含量的增加。

进一步的，所述目的植物为双子叶植物。

更进一步的，所述双子叶植物为拟南芥、烟草或油菜。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明用现有的植物表达载体构建含有BnNAC038基因的重组表达载体，所述植物表达载体有pEarley Gate103、pEarley Gate103-RFP(pEarleyGate103载体进行改造，在载体上加入红色荧光基因，并利用拟南芥种子特异性启动子At2S3A使其表达)或其它衍生植物表达载体。构建的含有本发明基因的重组表达载体可以通过DNA转化、电导、Ti质粒、农杆菌介导等生物学方法转化到植物组织或者细胞中，宿主双子叶植物可以是拟南芥、烟草和油菜等。

本发明提供的油菜耐旱性负调控基因BnNAC038在抗旱上起负调控作用，转基因植物中其过量表达会抑制编码参与非生物胁迫诱导的渗透或氧化损伤的响应基因表达，使转基因植物抗旱能力降低。

附图说明

图1构建的过表达载体图谱，pEarleyGate103-RFP-BnNAC038。

图2是阳性转基因拟南芥的筛选；A.改造载体的荧光筛选标记；B.转基因拟南芥纯合体筛选。

图3是各纯合转基因株系T3代转基因拟南芥的半定量RT-PCR检测电泳；BnActin为内参基因。

图4是过表达BnNAC038转基因拟南芥的耐旱性测定；A.BnNAC038转基因植株干旱处理；B.干旱处理后BnNAC038转基因植株和野生型拟南芥的存活率和植物叶片失水率测定；星号代表两个样本平均数t检验P值(*:P<0.05；**:P<0.01)；误差值：平均数±s.d。

图5是BnNAC038相关生理生化指标测定；A.离子渗透率的测定；B.脯氨酸含量的测定；C.叶绿素含量的测定；D.MDA含量的测定；星号代表两个样本平均数t检验P值(*:P<0.05；**:P<0.01)；误差值：平均数±s.d

图6是BnNAC038过表达拟南芥中胁迫相关基因的表达，星号代表两个样本平均数t检验P值(*:P<0.05；**:P<0.01)；误差值：平均数±s.d.

图7是BnNAC038转基因油菜植株干旱处理。

图8是BnNAC038转基因植株和野生型油菜的叶片失水率测定。

图9是BnNAC038过表达植株在干旱处理前后的活性氧和抗氧化酶活性变化；A.DAB和NBT染色；B.是CAT酶活测定；C.POD酶活测定；星号代表两个样本平均数t检验P值(*:P<0.05；**:P<0.01)；误差值：平均数±s.d。

图10是BnNAC038转基因油菜红外及气孔观测；A.生长3周的BnNAC038转基因油菜幼苗远红外检测BnNAC038转基因油菜叶面温度B.生长3周的BnNAC038转基因油菜幼苗气孔导度的测定(轻度干旱胁迫(LS,light stress)，中度胁迫(MS,moderate stress)，重度胁迫(SS,severe stress))；C和D.生长3周的BnNAC038转基因油菜幼苗叶片经ABA处理下气孔开度及统计；星号代表两个样本平均数t检验P值(*:P<0.05；**:P<0.01)；误差值：平均数±s.d。

图11是过表达BnNAC038油菜中胁迫相关基因的表达，星号代表两个样本平均数t检验P值(*:P<0.05；**:P<0.01)；误差值：平均数±s.d。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在本发明的下述实施例中，所用的实验材料为甘蓝型油菜(Brassica napus L.)。中双11由中国农业科学院油料作物研究所提供，K407由陕西省杂交油菜研究中心提供，拟南芥WT(Arabidopsis thaliana，Col-0；美国拟南芥生物资源中心)，农杆菌GV3101(上海唯地生物技术有限公司)，质粒pEarley-Gate103(美国拟南芥生物资源中心)。

实施例1甘蓝型油菜干旱敏感蛋白编码基因BnNAC038序列的克隆

利用RNA提取分离试剂(Trizol，Invitrogen)提取甘蓝型油菜幼苗总RNA其具体方法是：选取油菜幼苗新鲜的叶片加入2.0mL EP管中，加入干净的钢珠后冻入液氮。将冻好的样品放入高通量组织研磨仪中，45Hz研磨40s；研磨后将1mL Trizol溶液加入到每个EP管中，用手颠倒数次摇匀，放置到冰上5min；将200μL的氯仿加入到每个样品中，缓慢混匀之后冰上静置5min；将上述样品在4℃，12,000rpm的条件下离心10min；用移液枪吸取上层上清至新的RNase free EP管中，加入与上清等体积的-40℃预冷的异丙醇，上下颠倒混匀之后4℃，12,000rpm，离心15min；上清倒掉，先加入250μL的无水乙醇，再加入750μL RNase free水洗脱RNA，4℃，12,000rpm，离心5min，重复两次；最后将RNA置于冰上晾干，加入30μL的RNase free水溶解，放入-80℃保存。

通过RT-PCR扩增得到BnNAC038的cDNA序列，具体方法是：

使用南京Vazyme公司的HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒。首先配制gDNA去除反应体系(模板RNA 2μL，4×gDNA wiper Mix 4μL，RNase-free ddH2Oto 16μL)，配制好后，在旋涡振荡器上进行震荡混匀,42℃2min。吸取4ul第一步反应液，加入5×HiScript III qRT SuperMix 4ul，用移液器轻轻吹打混匀，然后在PCR仪中进行逆转录反应37℃，15分钟。85℃，5秒，即得BnNAC038的cDNA。

吸取适量上述产物作为模板进行PCR反应：95℃3min后进入扩增程序：95℃30s、58℃30s、72℃30s，32个循环后，72℃5min。对上述反应的产物进行电泳以此来初步判断扩增的结果，按照OMEGA DNA纯化回收试剂盒的步骤对扩增正确的目的基因产物进行纯化，得到油菜转录因子BnNAC038基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，序列后三位为终止密码子。

PCR所用引物如下：BnNAC038-F1如SEQ ID NO：3所示；BnNAC038-R1如SEQ ID NO：4所示。

实施例2转BnNAC038基因植株的获得

1、甘蓝型油菜BnNAC038基因植物过表达载体的构建：利用Gateway重组技术构建基因的过表达载体，首先在pEarleyGate103载体上加入RFP基因对其进行改造，利用拟南芥特异性启动子At2S3使其表达，改造后的载体被命名为pEarleyGate103-RFP。通过BP反应(BP Clonase II Enzyme Mix，Invitrogen)将目的基因连到pDONOR 207载体上，形成含目的基因的重组质粒。将测序正确的重组质粒与pEarleyGate103-RFP表达载体进行LR反应(LR Clonase II Enzyme Mix，Invitrogen No.11791-020)，将BnNAC038基因重组到pEarleyGate103-RFP载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L卡那霉素筛选得成功重组的过表达载体pEarleyGate103-RFP-BnNAC038，结果如图1所示。

2、农杆菌介导的转化：

将构建成功的过表达质粒pEarleyGate103-RFP-BnNAC038通过电转的方式转化农杆菌GV3101，用50mg/L利福平+50mg/L卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆。

拟南芥转基因植株的获得：将阳性克隆接种到含抗生素利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP液体培养基中培养，于恒温摇床上28℃，220rpm摇床培养至OD600＝0.8-1.2，离心后用侵染培养基(1/2MS，5％sucrose，0.05％silwetL-77，pH5.7)重悬OD600＝0.8-1.2。将拟南芥Col-0倒置使花苞浸没在侵染培养基溶液里30-40秒，用保鲜膜将侵染之后的拟南芥地上部分包裹，黑暗培养24h后去掉保鲜膜，正常条件(25℃，16小时光照、8小时黑暗)继续培养直至收获种子。

油菜转基因植株的获得：将消毒后的油菜种子点到MS培养基中，16/8h，光/暗培养5d。将下胚轴去掉生长点切成2mm左右长的切段，将切下的下胚轴插入预培养基中28℃、16/8h，光/暗预培养2d。将含有目的载体的农杆菌转化菌株接种于5mL含有50mg/L卡那霉素和20mg/L链霉素的YEP液体培养基中28℃，200rpm振荡培养1-2d，测其OD600约0.5即可。吸500μL上述菌液加入到50mL YEP液体培养基中28℃，200rpm振荡培养到OD600约为0.5。离心后用等体积MS液体培养基重悬下边菌种，加入100μmol/L的乙酰丁香酮，在摇床28℃，200rpm振荡培养2-3h。将含100μmol/L乙酰丁香酮的液体MS培养基重悬液稀释不同倍数后用于转化。将预培养的下胚轴放入上述转化液中浸泡8-10min，期间不断晃动转化液使其充分混匀。取出下胚轴放于无菌滤纸上，吸干表面菌液，然后放入铺有共培养基的培养皿中，先25℃暗培养2d，后16/8h，光/暗培养1d。将共培养后的下胚轴摆入脱菌培养基中，25℃，16/8h，光/暗培养5-7d。将脱菌培养后的下胚轴转移到分化筛选培养基，25℃，16/8h，光/暗培养，2-3周继代一次，直到有绿芽分化，正常条件继续培养直至收获种子。

3、转基因株系的筛选：

拟南芥转基因材料的筛选与鉴定：将转基因拟南芥收获的种子，在体式显微镜RFP下观察种皮颜色，挑选种皮上能观察到红色荧光的阳性种子进行种植，待拟南芥长到4-6叶时，提取DNA进行PCR鉴定，让鉴定阳性的材料继续生长，依此方法进行，经过传代，半定量PCR验证，最后得到纯合的BnNAC038过表达的拟南芥T3代转基因株系，结果如图2-3所示。

油菜转基因材料的筛选与鉴定：将收获的转基因种子萌发一天后在在体视荧光显微镜下挑选出胚乳呈红色荧光的阳性种子进行播种，提取转基因油菜和野生型油菜的DNA，进行PCR鉴定，挑选出阳性材料继续生长，依此方法最后筛选出纯合的过表达株系。

实施例3转BnNAC038基因拟南芥干旱敏感特性检测

1、检测过表达BnNAC038转基因拟南芥的耐旱性

选取在土壤中正常浇水生长3周的拟南芥幼苗，对其进行干旱/渗透胁迫的耐受性研究，将幼苗分别进行正常浇水处理和缺水干旱处理培养20天左右，BnNAC038转基因植株大部分萎蔫失水情况比WT严重；复水3天后WT干旱萎蔫情况得到缓解，叶片重新恢复绿色，而转基因植株大部分无法恢复，存活率显著低于WT。对植株的离体叶片进行失水率测量，结果表明，与野生型相比，过表达BnNAC038转基因株系叶片失水较快，结果如图4所示。

2、过表达BnNAC038转基因拟南芥的相关生理指标测定

在受到干旱胁迫时，植物体内的一些生理指标会发生相应地变化，这与它其抗旱性强弱存在的联系。我们分别测定了转基因植株和WT在干旱胁迫下的一些相关生理指标。根据检测结果，在干旱胁迫下测量转基因植株和野生型植株的离子渗透率，结果表明转基因植株叶片的离子渗透率要大于野生型植株，其叶片细胞膜的通透性受损较严重，结果如图5-A所示；脯氨酸作为植物体内的渗透保护剂，其在干旱胁迫下的含量变化可以在一定程度上代表抗旱能力的强弱，如图5-B、C所示，转基因拟南芥体内的脯氨酸含量以及叶片中的叶绿素含量显著低于野生型；如图5-D所示，MDA含量的测定也也显示在干旱后转基因拟南芥要显著高于野生型拟南芥，进一步说明了转基因拟南芥相比野生型拟南芥受干旱胁迫伤害较大。

3.转基因拟南芥胁迫响应基因的表达分析

在感受到外界胁迫信号时，植物可以通过激素信号转导而调控多种胁迫响应基因的表达，为植物响应和适应逆境胁迫奠定了重要的分子基础。为进一步研究转录因子BnNAC038在干旱胁迫响应中的功能，通过qRT-PCR分析了转基因拟南芥中AtDREB2A等胁迫响应基因的转录情况。如图6所示，在200mM Mannitol处理6h时，胁迫响应基因AtDREB2A、AtCOR47、AtRD29A等在WT和转基因拟南芥中的表达量相比对照都明显上调，但是，在转基因拟南芥中的表达水平要显著低于野生型拟南芥，尤其是AtDREB2A、AtRD29A的表达量要比WT低1.5-4倍左右。这些结果说明过表达BnNAC038影响了转基因拟南芥中AtDREB2A等胁迫响应基因干旱胁迫下的表达水平。

实施例4过表达BnNAC038基因油菜干旱敏感特性检测

1.过表达BnNAC038转基因油菜干旱敏感性测定

对在土壤中正常生长到3周的油菜幼苗分别进行缺水干旱处理和正常浇水处理。培养13天后，发现BnNAC038转基因植株出现严重的萎蔫失水甚至干枯死亡现象，而WT失水较轻，仍具有少量绿色叶片且其大部分都存活。复水一周后，WT大部分叶片恢复绿色，失水萎蔫情况得到缓解，而BnNAC038转基因植株大部分无法恢复正常状态，存活率显著低于WT，结果如图7所示。分别测量WT和转基因株系的离体叶片散失水分速度，结果如图8所示，WT的离体叶片失去水分的速度比BnNAC038转基因株系的水分丧失速度慢得多。

2.通过组织化学染色DAB和NBT测定油菜叶片活性氧的累计情况

植物受到胁迫时，体内活性氧含量和抗氧化酶的活性会发生改变。DAB和NBT染色可以测定植物组织中H

3.测量转基因油菜在干旱胁迫下的叶片温度、气孔开度以及气孔对ABA的敏感度

叶片蒸腾作用的快慢在一定程度上决定了植物对于干旱的耐受程度，叶片蒸腾失水会使叶片温度降低，失水较快的叶片温度相对失水慢的要低。如图10-A所示，检测干旱处理下转基因油菜和野生型油菜的叶片温度，发现转基因油菜的叶片温度相对野生型要低。叶片的水分流失和气孔有着密切关联，对转基因油菜的气孔开度和气孔导度进行实验，在同一时间点分别测量四周龄转基因植株和野生型植株油菜幼苗的第二片真叶的气孔导度，发现随着干旱胁迫程度加剧，气孔导度整体呈现出先升高后降低的变化趋势。但在整个干旱胁迫过程中，转基因油菜的气孔导度都显著高于野生型，结果如图10-B所示。

外源施加ABA刺激可以促进植物叶片气孔关闭，测量用ABA处理后叶片的开度发现，野生型油菜能够感知ABA信号并迅速关闭气孔，而转基因油菜的气孔对于ABA刺激不敏感，结果如图10-C、D所示。

4.BnNAC038转基因油菜抗旱相关基因表达量检测

通过qRT-PCR对转基因油菜中BnRD29A等胁迫响应基因的转录情况进行分析，结果如图11-A所示，相比与对照组，在20％PEG 6000处理3h的油菜幼苗中，BnSnRK2.6、BnRD29A、BnRD29B等胁迫响应基因在野生型油菜和转基因油菜中的表达量明显上调。但是，在转基因油菜中的表达水平要显著低于野生型油菜。这些结果说明过表达BnNAC038影响了转基因油菜中BnSnRK2.6等胁迫响应基因干旱胁迫下的表达水平。

由于中转基因油菜气孔对ABA的不敏感性，我们进一步检测了在外源ABA处理下与ABA通路相关基因表达量的变化。如图11-B所示，用30μM ABA处理3h的油菜幼苗中，BnSnRK2.6、BnABI4和BnSLAC1.2基因在转基因油菜中的表达量要显著低于野生型油菜，结果和20％PEG 6000模拟干旱处理类似。SnRK2.6是调节气孔关闭的重要调节因子，这一点与转基因油菜气孔对ABA不敏感的结果是一致的。由此，我们推测转基因油菜耐旱性降低，与干旱和ABA通路的相关基因的表达水平量降低具有一定关系。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 河南大学

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<120> 一种油菜耐旱性负调控基因及其应用

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<212> DNA

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