用于诊断甲状腺乳头状癌淋巴结转移的液体活检试剂盒

摘要

本发明提供了一种用于诊断甲状腺乳头状癌淋巴结转移的液体活检试剂盒，包括：用于检测hsa‑circ‑UMAD1的试剂；和用于检测半乳糖凝集素3的试剂。本发明构建了血浆hsa‑circ‑UMAD1联合半乳糖凝集素3的组合检测技术，为评价甲状腺乳头状癌患者淋巴结转移提供重要证据。

说明书

技术领域

本发明属于诊断试剂领域，具体而言，涉及用于诊断甲状腺乳头状癌淋巴结转移的液体活检试剂盒。

背景技术

近十年来，通常采用影像学和穿刺技术评估甲状腺乳头状癌(papillary thyroidcarcinoma，PTC)快速生长和早期转移危险因素。这些检测技术可有效地评估甲状腺切除术或淋巴结切除术患者术后是否会发生甲状腺乳头状癌淋巴结转移及预后程度，为指导手术的范围和手术方式提供了有力的证据。但由于这些检测手段具有的局限性，如所需设备价格昂贵又复杂以及穿刺对患者的身体具有创伤性，对寻找新的检测手段提出了迫切要求。因此，液体活检技术(即从患者血液中发现能准确预测甲状腺乳头状癌淋巴结转移的标志物)应运而生，且越来越受到国内外研究者的关注。但该技术在甲状腺乳头状癌中应用极少，目前仅限于检测miRNAs、BRAF和P53突变，如血清P53蛋白的表达。肿瘤发生发展过程中容易出现新的驱动基因及突变，因此，建立灵敏、方便、高效的外周循环标志物的检测系统对甲状腺乳头状癌中淋巴结转移的预测具有一定的可行性和价值。

环状RNA广泛参与人类肿瘤组织、发育和疾病过程。环状RNA作为一种新发现的非编码RNA分子，其作用方式多种多样，如海绵吸附miRNA，释放miRNA靶标的抑制作用，翻译特定肽或与RNA结合蛋白相互作用调控蛋白。由于环状RNA在血液中表达很稳定，不容易降解，因而成为液体活检的重要领域。

发明内容

基于液体活检技术，本发明人建立了一种新的组合检测技术，即将甲状腺乳头状癌患者血液特异性环状RNA(circular RNA，简称circRNA)检测技术与半乳糖凝集素3(Galectin3，Gal-3)检测技术有效的结合，这种组合检测技术不仅能兼顾检测结果的特异性和敏感性两方面，而且能有效地判断甲状腺乳头状癌淋巴结的转移情况。

本发明人通过环状RNA测序，成功获取甲状腺乳头状癌肿瘤原发和淋巴结转移组织之间的差异环状RNA，发现了潜在的肿瘤生物标志物。本发明人同时筛选到了原发肿瘤和淋巴结转移的测序数据，发现hsa-circ-UMAD1是与淋巴结转移相关的环状RNA，它对miRNA-873起海绵吸附作用。

本发明人已有的研究显示，半乳糖凝集素3的分泌与肿瘤的恶性行为及肿瘤细胞的迁移密切相关，诱导分泌转移促进细胞因子参与肿瘤发生。因此，发明人构建了血浆hsa-circ-UMAD1联合半乳糖凝集素3的组合检测技术，为评价甲状腺乳头状癌患者淋巴结转移提供重要证据。

因此，本发明的一个目的是提供一种用于诊断甲状腺乳头状癌淋巴结转移的液体活检试剂盒。

本发明的另一个目的是提供用于检测hsa-circ-UMAD1的试剂和用于检测半乳糖凝集素3的试剂在制备用于诊断甲状腺乳头状癌淋巴结转移的液体活检制品中的用途。

本发明的再一个目的是提供一种诊断甲状腺乳头状癌淋巴结转移的液体活检方法。

一方面，本发明提供了一种用于诊断甲状腺乳头状癌淋巴结转移的液体活检试剂盒，包括：用于检测hsa-circ-UMAD1的试剂；和用于检测半乳糖凝集素3的试剂。

另一方面，本发明提供了用于检测hsa-circ-UMAD1的试剂和用于检测半乳糖凝集素3的试剂在制备用于诊断甲状腺乳头状癌淋巴结转移的液体活检制品中的用途。

本发明中，所述hsa-circ-UMAD1的序列如SEQ ID NO：1(5’-GGGAGAAGAGAAGGGATTTGACTGAGACAAGTTGATTTGAGTGAAGCCGCTACTCTTAGACAACTTTGCATAAAACAGCTGATTTTCTGTGATTTCTACAGGAAGCAAAGCCAGCAGTCAGTGACATCAAGACTTAAGAAGATTGAAAAATGTCCCATCTTCAGAGGAAATCTAGGAGATACAACAGATGAGCAAAGAATGACAGAAAGAGGCAAAACTTCGGACATAGAGGCCAACCAACCTTTGGAGA-3’)所示。

再一方面，本发明提供了一种诊断甲状腺乳头状癌淋巴结转移的液体活检方法，包括对受试者的血液样本进行血浆hsa-circ-UMAD1联合半乳糖凝集素3的组合检测的步骤。

具体地，本发明的诊断甲状腺乳头状癌淋巴结转移的液体活检方法包括以下步骤：

(1)取新鲜外周血标本以得到血浆样本；

(2)将上述血浆样本分成两份，一份用于hsa-circ-UMAD1的检测，另一份用于半乳糖凝集素3的检测。

优选地，步骤(1)中，在EDTA管中采集血浆样品，1500转离心分离，2小时内其中一份血浆样本不经冷冻立即用于RNA提取，另一份直接完成酶联免疫吸附(可冷冻，亦可不冷冻)。

优选地，步骤(2)中，可以联合使用两种试剂盒，一种是用于检测hsa-circ-UMAD1的实时定量试剂盒，另一种是用于检测半乳糖凝集素3的酶联免疫吸附试剂盒。

本发明中，用于检测hsa-circ-UMAD1的试剂可以使用领域中任何用于检测hsa-circ-UMAD1的试剂。例如，M-MLV逆转录试剂盒(Invitrogen,美国产)。在一个实施方式中，用于检测hsa-circ-UMAD1的试剂包括上游环状RNA circ-UMAD1引物(5’-CCAACCAACCTTTGGAGAGTG-3’(SEQ ID NO：2))；下游环状RNA circ-UMAD1引物(5’-AGTCAAATCCCTTCTCTTCTCCC-3’(SEQ ID NO：3))。

附图说明

图1是显示甲状腺乳头状癌患者淋巴结转移呈显著性正相关的基因的图，图中英文为基因名称。

图2A至2F是血液循环中的环状RNA作为预测甲状腺乳头状癌淋巴结转移的生物标志物的图。

其中：2A：寻找策略；2B：免疫组化验证；2C：测序结果分析；2D：KEGG生物信息分类验证；2E：KEGG通路分析揭示miRNA在癌症及淋巴组织中参与了许多生物学过程；2F：KEGG通路分析揭示环状RNA在癌症及淋巴组织中参与了许多生物学过程。

图3是miR-873与半乳糖凝集素3相关图。

其中：A：TCGA分析数据表明9个miRNAs与发明人测序结果一致；B：通过多维分析得到miR-873为候选基因；C：甲状腺乳头状癌淋巴结转移患者的miR-873表达更高。

图4是环状RNA:circRNA-UMAD1与miR-873的关系图。

其中：A：数据库和测序结果定向表明3个候选分子；B：hsa_circ_0001676作为可能最有利的候选环状RNA；C：circRNA-UMAD1与miR-873的结合位点；D：双荧光素酶报告基因检测证实；E：circRNA-UMAD1表达越高，miR-873表达越低。

图5是血液循环中hsa-circ-UMAD1对甲状腺乳头状癌淋巴结转移的评价图。

其中：A：编码蛋白UMAD1在甲状腺乳头状癌样本中与淋巴结表达相关；B：50例患者临床病理特征与hsa-circ-UMAD1水平的相关性；C：hsa-circ-UMAD1表达越高，半乳糖凝集素3表达越高。

图6是hsa-circ-UMAD1和半乳糖凝集素3的ROC曲线分析图。

其中：A：hsa-circ-UMAD1 ROC曲线；B：半乳糖凝集素3ROC曲线；C：联合两者的ROC曲线。

具体实施方式

本发明中，用于检测半乳糖凝集素3的试剂可以使用领域中任何用于检测半乳糖凝集素3的试剂。例如，抗体稀释液，重组半乳糖凝集素3蛋白(Santa Cruz,美国)。

研究表明，半乳糖凝集素3在包括甲状腺乳头状癌在内的多种恶性肿瘤中均有高表达，因此半乳糖凝集素3可作为恶性肿瘤的预测指标之一。然而，半乳糖凝集素3在外周循环表达水平低，因此其测试的灵敏度不高。而且，半乳糖凝集素3也不是甲状腺乳头状癌淋巴结转移样本中表达最高的基因之一，发明人需要另外一个生物标志物联合检测来提高预测诊断的准确性，找到特异性和敏感性两者的平衡点。本研究通过RNA测序和生物信息学分析，发现了许多与半乳糖凝集素3的临床特性和病理特征高度相关的靶点。半乳糖凝集素3作为诊断PTC的生物标志物之一，对甲状腺乳头状癌的鉴别诊断准确率应大于65％。与最近报道的高达70.6％敏感度和96.8％特异度相比，半乳糖凝集素3的59.26％的敏感度和96.67％的特异度不足以准确检测微小淋巴结转移样本。因此，在没有足够的肿瘤组织用于检测的时候，要想半乳糖凝集素3能够在液体活检中得到广泛应用，还需要和另外一个标志物联合检测以提高其敏感度及特异度。

最新的研究发现环状RNA可以作为非侵入性检测的指标，因为其在血浆中稳定且特异性高。发明人决定探索影响miR-873-半乳糖凝集素3的新的环状RNA，因为环状RNA是RNA的闭合连续循环，具有miRNA结合位点，可以作为miRNA的海绵来调节miRNA功能。为此，环状RNA预测网站设计并分析了circRNA/miR-873/半乳糖凝集素3分子链的相互作用。与测序结果一致，hsa-circ-UMAD1被确定为进一步筛选的候选基因。发明人确定hsa-circ-UMAD1作为miR-873海绵在体外抑制miR-873的表达。由于环状RNA在肿瘤细胞内外相对稳定，甚至以核酶的形式存在，因此使用正确的技术从新鲜血液样本中提取环状RNA并不困难。通过RT-PCR扩增血浆中的环状RNA，分析其临床特征与病理特征的关系。hsa-circ-UMAD1在LNM样本中的高表达被确定为甲状腺乳头状癌患者淋巴结转移的一个新的生物标志物。幸运的是，hsa-circ-UMAD1和半乳糖凝集素3表达显著相关，且R值较高。这表明hsa-circ-UMAD1是一个很好的预测淋巴结转移的生物标志物。而hsa-circ-UMAD1的ROC曲线略小于半乳糖凝集素3(AUC:0.7531VS.0.8407)。结合hsa-circ-UMAD1和半乳糖凝集素3的ROC分析结果，特异性达到100％，敏感性从59.26％提高到74.07％。对于伴有淋巴结转移的甲状腺乳头状癌患者，hsa-circ-UMAD1和半乳糖凝集素3双高表达患者淋巴结转移机会风险增加。如果能够持续观测血液中的这两个指标，就能判断甲状腺乳头状癌患者淋巴结转移可能发生的时间，从而进行进一步的治疗。

在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。

下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例

实施例1：hsa-circ-UMAD1联合半乳糖凝集素3的组合检测方案的建立(一)使用酶联免疫吸附试剂盒检测外周血循环中半乳糖凝集素3与甲状腺乳头状癌患者淋巴结转移相关

试剂：酶标包被板；半乳糖凝集素3标准品；标准品稀释液；生物素标记的半乳糖凝集素3抗体；显色液A；显色液B；终止液；酶标试剂；浓缩洗涤液。

方法：

1.标准品的稀释：准备小试管6只，依次编好号码，先在各小试管中加入标准品稀释液100μl，然后取原浓度标准品100μl加入一只已编好号的试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加入第二支试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加入第三只试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加入第四只试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加入第五只试管中，充分混匀；然后在该试管中取100μl，弃掉。第六只试管作为0号标准品。稀释后各管浓度分别是：1200pg/ml，600pg/ml，300pg/ml，150pg/ml，75pg/ml在酶标包被板上设标准品孔，依次加入不同浓度的标准品50μl(建议每个浓度做2个平行孔)。

2.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品、酶标试剂及生物素标记的抗LOX抗体，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品40μl，然后再加生物素标记的半乳糖凝集素3抗体10μl。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

实验结果计算：

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，即为样品的实际浓度。

首先通过分析6个不同的数据库中的424名患者的研究数据，半乳糖凝集素3已被证明是在甲状腺乳头状癌患者淋巴结转移中的一个潜在的生物标志物。进一步分析来自8000名患者(17个主要癌症类型的细胞和组织)人类蛋白质图谱的数据，发明人发现相比其他实体肿瘤，半乳糖凝集素3高度表达在甲状腺乳头状癌中。基于这些观察，发明人决定验证乳糖凝集素3在甲状腺乳头状癌被诊断为伴有或不伴有淋巴结转移的甲状腺乳头状癌患者外周血循环中的表达。发明人选取了男性12例，女性38例，年龄24-63岁之间，确诊为单侧甲状腺乳头状癌44例，双侧甲状腺乳头状癌6例，行甲状腺切除术+淋巴结清扫27例，未行淋巴结清扫23例。如表1所示，通过检测患者血液中乳糖凝集素3的水平，发明人发现乳糖凝集素3水平与临床淋巴结转移特性显著相关。对甲状腺乳头状癌TCGA数据的分析显示，与正常组织相比，乳糖凝集素3不仅在甲状腺乳头状癌肿瘤中高表达，而且与肿瘤分期和LNM高度相关。这些数据表明，乳糖凝集素3是诊断甲状腺乳头状癌患者淋巴结转移的一个有用的生物标志物。然而，在所有与甲状腺乳头状癌患者淋巴结转移呈显著性正相关的基因中，它排名并不是最靠前的，仅仅位于前38位(图1)，所以还需要找到一个在血液中更能代表甲状腺乳头状癌患者淋巴结转移的补充指标，作为共同标志物。

表1使用半乳糖凝集素3酶联免疫吸附试剂盒检测的病例标本

1qRT-PCR定量。将Gal-3定量以GAPDH为参照。2两组比较采用Mann-Whitney U检验或更多组采用Kruskal-Walis检验。3两组比较的采用非配对学生t检验。

(二)研究策略的选择

由于仅检测半乳糖凝集素3在甲状腺乳头状癌患者预测淋巴结转移方面存在局限性，发明人认为其它潜在的分子可能是淋巴结转移更敏感的生物标志物。为了明确循环系统中是否存在这种环状RNA和MicroRNA(miRNA)，发明人通过测序确定哪些环状RNA和miRNA在淋巴结转移样本中上调。最终目的是通过乳糖凝集素3找到对应下调的微小RNA，再从微小RNA出发，找到对应上调的环状RNA(图2A)。并经病理诊断证实具有淋巴结转移特性(图2B)。结果显示，在淋巴结转移样本中，总共有208个环状RNA和134个miRNA表达上调，184个环状RNA和86个miRNA表达下调。KEGG通路分析揭示了环状RNA和miRNA分别在癌症及淋巴组织中参与了许多生物学过程(图2E,F)。这些结果表明循环中的环状RNA和miRNA可以作为预测淋巴结转移的生物标志物。

(三)miR-873与半乳糖凝集素3相关

微小RNA是有用的诊断指标。利用TCGA分析数据(图3A)，发明人发现miR-873是甲状腺乳头状癌淋巴结转移相关的首选基因之一，通过筛选miRNA测序数据和3个miRNA数据库的预测分析，预测miR-873靶向半乳糖凝集素3(图3B)。接下来，发明人使用含有半乳糖凝集素3的3'-UTR的载体进行荧光素酶报告基因检测，该载体位于miR-873在半乳糖凝集素3中的假定结合位点两侧。因此，半乳糖凝集素3的3'-UTR中的miR-873结合位点负责抑制报告基因的活性，这表明miR-873通过其3'-UTR直接调节该基因的表达，甲状腺乳头状癌淋巴结转移患者的miR-873水平强于原发性PTC患者(图3C)。因此，miR-873是直接靶向半乳糖凝集素3的候选标志物。也是甲状腺乳头状癌淋巴结转移的潜在指标，但是由于miR-873低表达才能预示作用，所以，它不适合为血液检测指标。

(四)循环中circRNA-UMAD1扮演miR-873海绵吸附的角色，使得血液中很难检测出微小RNA。

在探索有无甲状腺乳头状癌淋巴结转移患者血液循环中miR-873表达差异的基础上，以fold change>2、P值<0.05为标准，通过网站预测工具筛选差异表达的环状RNA(图4A)。发明人利用生物信息学分析确定3个环状RNA，分别是hsa_circ_0000111,hsa_circ_0000277,hsa_circ_0001676。鉴于hsa_circ_0000111,hsa_circ_0000277在淋巴结中的高本底水平，这两个环状RNA未被考虑为靶标(图4B)。最终，hsa_circ_0001676被验证为候选，即hsa-circ-UMAD1。此外，通过双荧光素酶报告基因检测证实了hsa-circ-UMAD1和miR-873二者的互补结合(图4C,D)。通过Pearson相关分析确定了甲状腺乳头状癌样品中hsa-circ-UMAD1与miR-873的表达呈负相关(图4E)。因此，以上结果表明hsa-circ-UMAD1直接靶向miR-873，对miR-873起海绵抑制作用。

(五)血液循环中hsa-circ-UMAD1对甲状腺乳头状癌淋巴结转移的诊断有潜在的预后价值

试剂：裂解液(主要成分Trizol)；提取总RNA的纯化柱(Qiagen miRNeasy MiniKit德国)；RNA酶R；短片段RNA纯化柱(Qiagen RNeasy MiniElute Purification Kit德国)；dNTP；随机引物；逆转录酶M-MLV；DTT；PCR混合试剂(PowerUptm SYBR Green MaterMix，美国)；上游GAPDH引物(通用)；下游GAPDH引物(通用)；上游环状RNA circ-UMAD1引物(5’-CCAACCAACCTTTGGAGAGTG-3’(SEQ ID NO：2))；下游环状RNA circ-UMAD1引物(5’-AGTCAAATCCCTTCTCTTCTCCC-3’(SEQ ID NO：3))。

方法：使用Trizol裂解液300μl新鲜血浆中提取总RNA，利用Qiagen miRNeasyMini Kit完成总RNA的纯化。将总RNA与5U RNase R共20μl反应体系，在37℃下反应30分钟。利用Qiagen RNeasy MiniElute Purification Kit完成段短片段RNA的纯化，得到实验所需的纯化RNA。接着，将10ng RNA混合dNTP和随机引物，加入逆转录酶M-MLV和DTT，在37℃下反应60分钟，将RNA逆转录为cDNA。逆转录后的cDNA加入PCR混合试剂后，分别给与GAPDH或环状RNA circ-UMAD1引物，在标准程序下进行PCR扩增，分析扩增效率。基于2-

circRNA-miRNA关联性的识别有助于甲状腺乳头状癌淋巴结转移的诊断，hsa-circ-UMAD1符合筛选标准。该环状RNA的亲本基因编码蛋白UMAD1，该蛋白在发明人的甲状腺乳头状癌样本中与淋巴结表达相关(图5A)。与测序结果一致，hsa-circ-UMAD1在淋巴结转移瘤中的表达高于原发瘤部位。通过RT-PCR分析50例患者临床病理特征与hsa-circ-UMAD1水平的相关性(图5B)，结果表明hsa-circ-UMAD1的表达水平在性别、年龄、肿瘤大小和血管侵犯方面无显著差异。而在LNM样本中，hsa-circ-UMAD1的表达明显高于无局部肿瘤侵袭的原代样本(表2)。此外，hsa-circ-UMAD1和半乳糖凝集素3的表达水平与高R值显著相关(0.35,p<0.0138)(图5C)。因此，hsa-circ-UMAD1是预测甲状腺乳头状癌淋巴结转移潜在风险的候选生物标志物。

表2

(六)hsa-circ-UMAD1和半乳糖凝集素3的ROC曲线分析表明联合检测可以提高甲状腺乳头状癌淋巴结转移的检出灵敏性和特异性

为了评估所鉴定的循环中hsa-circ-UMAD1和半乳糖凝集素3是否能作为诊断甲状腺乳头状癌淋巴结转移的潜在生物标志物，发明人对验证的样本生成ROC曲线。在ROC分析中，如果只单独分析hsa-circ-UMAD1或半乳糖凝集素3，特异性和敏感性不理想。半乳糖凝集素3的ROC曲线下面积为0.8407,hsa-circ-UMAD1的ROC曲线下面积为0.7531(图6A,B)。半乳糖凝集素3组的ROC曲线的敏感度为59.26％，特异性为96.67％。此外，在hsa-circ-UMAD1组中，最高的似然比为18.18％的敏感性和97.83％的特异性。虽然每个目标都记录了高特异性，但敏感性仍然不令人满意。结合两组结果，预测甲状腺乳头状癌淋巴结转移的敏感性为74.07％，特异度为100％(图6C)。这些结果表明，hsa-circ-UMAD1和半乳糖凝集素3的联合表达是预测甲状腺乳头状癌淋巴结转移的一个敏感的新生物标志物。

实施例2：hsa-circ-UMAD1联合半乳糖凝集素3的组合检测方案的实施

研究方案：

1.取新鲜外周血标本。在EDTA管中采集血浆样品，1500转离心分离。2小时内其中一份血浆样本不经冷冻立即用于RNA提取，另一份直接完成酶联免疫吸附(可冷冻，亦可不冷冻)。

2.联合使用两种试剂盒，一种是实时定量试剂盒，另一种是酶联免疫吸附试剂盒。

具体方法：

2.1使用实时定量试剂盒(Invitrogen美国公司)检测hsa-circ-UMAD1

2.1.1试剂：裂解液(主要成分Trizol)；提取总RNA的纯化柱(Qiagen miRNeasyMini Kit德国)；RNA酶R；短片段RNA纯化柱(Qiagen RNeasy MiniElute Purification Kit德国)；dNTP；随机引物；逆转录酶M-MLV；DTT；PCR混合试剂(PowerUptm SYBR Green MaterMix，美国)；上游GAPDH引物(通用)；下游GAPDH引物(通用)；上游环状RNA circ-UMAD1引物(5’-CCAACCAACCTTTGGAGAGTG-3’(SEQ ID NO：2))；下游环状RNA circ-UMAD1引物(5’-AGTCAAATCCCTTCTCTTCTCCC-3’(SEQ ID NO：3))。

2.1.2方法：使用Trizol裂解液300μl新鲜血浆中提取总RNA，利用QiagenmiRNeasy Mini Kit完成总RNA的纯化。将总RNA与5U RNase R共20μl反应体系，在37℃下反应30分钟。利用Qiagen RNeasy MiniElute Purification Kit完成段短片段RNA的纯化，得到实验所需的纯化RNA。接着，将10ng RNA混合dNTP和随机引物，加入逆转录酶M-MLV和DTT，在37℃下反应60分钟，将RNA逆转录为cDNA。逆转录后的cDNA加入PCR混合试剂后，分别给与GAPDH或环状RNA circ-UMAD1引物，在标准程序下进行PCR扩增，分析扩增效率。基于2-

2.2使用酶联免疫吸附试剂盒(Bio-Swamp公司，中国北京)检测半乳糖凝集素3

2.2.1试剂：酶标包被板；半乳糖凝集素3标准品；标准品稀释液；生物素标记的半乳糖凝集素3抗体；显色液A；显色液B；终止液；酶标试剂；浓缩洗涤液。

2.2.2方法：

1.标准品的稀释：准备小试管6只，依次编好号码，先在各小试管中加入标准品稀释液100μl，然后取原浓度标准品100μl加入一只已编好号的试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加入第二支试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加入第三只试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加入第四只试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加入第五只试管中，充分混匀；然后在该试管中取100μl，弃掉。第六只试管作为0号标准品。稀释后各管浓度分别是：1200pg/ml，600pg/ml，300pg/ml，150pg/ml，75pg/ml在酶标包被板上设标准品孔，依次加入不同浓度的标准品50μl(建议每个浓度做2个平行孔)。

2.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品、酶标试剂及生物素标记的抗LOX抗体，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品40μl，然后再加生物素标记的半乳糖凝集素3抗体10μl。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

2.2.3实验结果计算

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式y＝a+bx，y:样品实际浓度；a标准品浓度；b标准品OD值；x：样品实际OD值

计算出样品浓度，即为样品的实际浓度。

如果上述两项结果数值持续增高，则表明具有发生甲状腺乳头状癌淋巴结转移的风险增高。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京市肿瘤防治研究所

<120> 用于诊断甲状腺乳头状癌淋巴结转移的液体活检试剂盒

<130> DI20-1169-XC37

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hsa-circ-UMAD1

<400> 1

gggagaagag aagggatttg actgagacaa gttgatttga gtgaagccgc tactcttaga 60

caactttgca taaaacagct gattttctgt gatttctaca ggaagcaaag ccagcagtca 120

gtgacatcaa gacttaagaa gattgaaaaa tgtcccatct tcagaggaaa tctaggagat 180

acaacagatg agcaaagaat gacagaaaga ggcaaaactt cggacataga ggccaaccaa 240

cctttggaga 250

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 上游环状RNA circ-UMAD1引物

<400> 2

ccaaccaacc tttggagagt g 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 下游环状RNA circ-UMAD1引物

<400> 3

agtcaaatcc cttctcttct ccc 23