一种双氢中美菊素C的用途

摘要

本发明公开了一种双氢中美菊素C的用途，所述用途是指以双氢中美菊素C或其药学上可接受的盐等中的一种或多种作为活性成分用于制备抗炎药物，且该药物具有免疫调节作用。实验结果表明，双氢中美菊素C可以降低机体对感染或诱导产生的过度免疫反应，减轻脓毒症治疗中难以控制的危急症状，具有药用价值。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及双氢中美菊素C的抗炎和免疫调节用途。

背景技术

过度炎症反应的发生越来越被认为是脓毒症致死的一个关键因素，特别是在出院后。根据《脓毒症和感染性休克第三版国际共识定义》，脓毒症是由于宿主对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍，是一种具有复杂免疫病理生理的临床疾病，在脓毒症期间，炎症和免疫抑制可能依次或同时发生。在全身炎症反应的早期，如果免疫系统及时清除病原体，可以迅速恢复免疫平衡。如果不及时清除病原体，就会导致免疫调节失衡。在这种情况下，患者容易发生继发感染，导致长期免疫抑制、免疫功能衰竭，甚至身体残疾，也称为持续性炎症免疫抑制分解代谢综合征，这在其他非感染损伤引起的危重疾病中也很常见，如继发的重大创伤、胰腺炎等。

由于过度炎症反应和免疫抑制不是独立发生的，它们在脓毒症的病理过程中经常共存。因此，脓毒症的治疗较为棘手，是导致住院和重症监护病房(ICU)死亡的最常见原因，也是造成严重创伤患者长期死亡的主要原因之一，脓毒症幸存者在出院后的第一年死亡率为15％，在接下来的5年死亡率为6.8％。近年来，抗炎与免疫调节相结合的治疗方法已成为研究热点。如使用乌司他丁(UTI)和Tα1进行免疫调节治疗，可改善严重脓毒症患者的器官功能并降低死亡率。但药物的联合用药方式、最佳剂量、疗程等仍需临床研究进一步证实。此外，在严重感染时机体产生的过度免疫反应本身也是导致脓毒症高死亡率的一个重要因素，因此控制过度免疫反应亦是治疗的一个有效方向。

双氢中美菊素C(3-epi-Zaluzanin C、isozaluzanin C，DHZD)是一种倍半萜类化合物(Li,C.；Yu,X.；Lei,X.“A Biomimetic Total Synthesis of(+)-Ainsliadimer A”Org.Lett.2010,12,4284-4287.)，双氢中美菊素C(如以下化合物1所示)含有烯丙醇结构基团，不存在位于相应羟基与双键之间的共轭体系，而在去氢中美菊素C(如以下化合物2所示)中具有α，β-酮结构基团，该基团属于共轭体系。目前尚未见到有关双氢中美菊素C作为抗炎和免疫调节药物的活性成分的报道。

去氢中美菊素C尽管具有一定的抗炎、抗菌作用(中国专利CN105640937A、CN112587517A)，但受限于其细胞毒性，并未在动物实验中开展深入的研究，例如针对严重脓毒症模型。

发明内容

本发明提供一种双氢中美菊素C的用途，该用途以开发双氢中美菊素C在减轻脓毒症等疾病临床治疗中难以控制的危急症状方面的药用价值为目的。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

在用来模拟脓毒症的动物模型中，通过实验发现双氢中美菊素C(DHZD)可以在感染耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)的小鼠脓毒症休克、脓毒症模型中，对小鼠的体温、脏器发挥明显的保护作用；在致死剂量革兰氏阴性细菌脂多糖(LPS)诱导的小鼠脓毒症休克模型中，DHZD可以提高小鼠的存活率，用DHZD进行干预可以下调脓毒症小鼠血清中炎症因子和趋化因子(如IL-6、TNF-α、IL-10和MCP-1)的表达量。

在参与炎症反应的重要固有免疫细胞(单核/巨噬细胞、树突状细胞)中，通过实验发现DHZD可以抑制PI3K/Akt/p70S6K信号通路的活化，从而下调白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、趋化因子(如MCP-1)、干扰素β(IFN-β)、白细胞介素10(IL-10)等细胞因子的表达量。

以上实验结果表明DHZD能够通过抑制LPS诱导的过度炎症反应，从而减少因过度炎症反应引起的机体损伤，甚至死亡。而在CRKP感染导致的脓毒症的治疗中，DHZD可以通过调控宿主免疫反应从而降低机体对病原菌感染产生的过度免疫应答，减轻脓毒症难以控制的危急症状。因此，本发明所述的双氢中美菊素C的用途，具体是指以双氢中美菊素C及其立体异构体、前体化合物、药学上可接受的盐中的一种或多种作为具有免疫调节作用的活性成分用于制备抗炎药物，尤其是用于制备结合免疫调控达到抗炎目的的药物。

作为优选方案，所述具有免疫调节作用的活性成分(例如双氢中美菊素C)单独用药，或者具有免疫调节作用的活性成分(例如双氢中美菊素C)与抗生素、激素中的一种或多种联合用药，所述抗生素选自碳青霉烯类抗生素、喹诺酮类抗生素中的一种或多种，例如美罗培南、左氧氟沙星，所述激素选自临床常用糖皮质激素地塞米松。

作为优选方案，所述药物中除了含有有效成分(例如具有免疫调节作用的活性成分)之外，还含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或药学上可接受的载体，例如所述药物中还可以含有甜味剂以改善口味、抗氧化剂以防止氧化，以及各种制剂所必要的辅料等。

作为优选方案，所述药物的剂型不限，只要是能够使有效成分到达体内的剂型都可以，例如所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、粉末、颗粒剂、滴丸、糖浆、溶液、悬浮液、注射剂、酊剂、口服液、气雾剂、口含剂、冲剂、丸剂、散剂等常见剂型或纳米制剂等缓释剂型。

以上技术方案中，所述“药学上可接受的盐”是指双氢中美菊素C与药学上可接受的无机酸或有机酸所形成的盐，所述无机酸为盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸或硫酸；所述有机酸为甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、1,5-萘二磺酸、亚细亚酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸或氨基酸；所述“药学上可接受的”是指适用于人而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比。

以上技术方案中，所述“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，例如：顺反异构体、对映异构体、构象异构体等。

以上技术方案中，所述“前体化合物”是指在体外无活性，但能够在生物体内进行代谢或化学反应转化为双氢中美菊素C，从而发挥其药理作用的化合物。

本发明的有益效果体现在：

本发明通过实验揭示了双氢中美菊素C可以降低机体对病原菌感染、内毒素诱导产生的过度炎症反应，对脓毒症发挥体温和脏器保护作用，以及提高严重脓毒症的存活率。实验结果表明，双氢中美菊素C在抗炎和免疫调节药物中能够作为有效成分进行应用(包括单独用药，或通过与抗生素、激素联合用药增强疗效)，具有重要药用价值，并且为寻找新型候选药物和探索更加有效的治疗策略提供重要参考。

附图说明

图1为不同浓度的DHZD和Raw264.7细胞共孵育(12、24、48和72h)后在450nm波长检测细胞存活率(A)，以及Raw264.7细胞(2×10

图2为小鼠原代腹腔巨噬细胞(3.5×10

图3为BMDCs(以3.5×10

图4为雌性C57BL/6小鼠(随机分到6组中，每组10只)按每只小鼠腹腔注射12.5mg/kg的LPS后经DHZD单独干预或DHZD与DXM联合干预情况下存活率的变化(*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；****,p<0.0001)。

图5为PBS组、LPS(10mg/kg)组、LPS+DXM(5mg/kg)组、LPS+DHZD(40mg/kg)组、LPS+DXM(5mg/kg)+DHZD(10mg/kg)组雌性C57BL/6小鼠(随机分到5个组里，每组9只小鼠)在注射药物后12h ELISA检测血清(取小鼠眼球血制备血清)中IL-6(A)、TNF-α(B)、MCP-1(C)和IL-10(D)的分泌(*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001)。

图6为PBS组、CRKP(9×10

图7为PBS组、CRKP(6×10

图8为Raw264.7细胞(以1×10

具体实施方式

下面结合附图和实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于解释本发明，而不用于限制本发明的保护范围。

(一)药理实验

(1)DHZD对Raw264.7细胞的体外抗炎活性

1.样品制备

将双氢中美菊素C(DHZD)用二甲基亚砜(DMSO)溶解成100mg/mL，进一步用PBS(磷酸盐缓冲溶液)稀释成40mg/mL的储存液。进一步用无血清的DMEM细胞培养基稀释成为3、5、10、15μM梯度浓度的样品溶液(另配制不含DHZD的0μM样品溶液)；以100ng/mL的脂多糖(LPS)作为细胞水平实验的刺激物。

2.实验方法

1)小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞的培养

用含10％ FBS的DMEM高糖培养基进行传代培养，在37℃、5％CO

2)细胞增殖/毒性检测

不同浓度的DHZD和Raw264.7细胞共孵育后，根据CCK-8试剂盒说明书的实验步骤，每孔加入10μL CCK8增强型溶液，加完试剂后轻柔晃动培养板以帮助混匀，培养箱内孵育2h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。细胞存活率计算公式如下：

细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％

式中，As为药物实验孔吸光度；Ac为阴性对照孔吸光度；Ab为空白孔吸光度。

3)酶联免疫吸附试验(ELISA)

按照试剂盒说明书的步骤，溶解标准品、捕获抗体、检测抗体，标明稀释倍数分装存放于-20℃低温冰箱。①根据样品数和标准品总数用无菌PBS稀释捕获抗体(Captureantibody)至工作浓度，连续加样枪加入板中，100μL/孔，包被ELISA板，室温静置过夜；②第二天弃去捕获抗体，用排枪每孔加入300μL洗液(Wash buffer，含0.05％Tween20的PBS，pH7.2～7.4)，1min后拍板纸上拍干洗液，清洗3遍，最后一遍后确保孔中无残留洗液；③加入试剂稀释液(Reagent diluent，1％BSA的PBS pH 7.2～7.4)300μL/孔，贴上封板膜，室温封闭1h；④弃去试剂稀释液，重复第②步洗板操作；⑤分别加入待测样品(细胞培养上清，适当稀释)和标准品100μL/孔，贴上封板膜，室温孵育2h；⑥弃去待测样品和标准品，重复第②步洗板操作；⑦用试剂稀释液将检测抗体(Detection antibody)稀释至工作浓度，按100μL/孔加入，室温孵育2h；⑧弃去检测抗体，重复第②步洗板操作；⑨加入用稀释液稀释至工作浓度的偶联辣根过氧化物酶(HRP)100μL/孔，室温避光孵育20min；⑩弃去HRP，重复第②步洗板操作；

3.测定及统计方法

使用CCK-8检测药物对细胞的毒性，ELISA检测上清中细胞因子的分泌。各组实验结果采用T检验进行统计学分析，数据用平均数

4.实验结果

实验结果如图1所示：在Raw264.7细胞中，观察到72h内0～15μM的DHZD均无细胞毒性，不影响细胞正常生长。而且，DHZD的干预能抑制LPS刺激产生的IL-6、TNF-α、MCP-1、IFN-β、IL-1β和IL-10的分泌，并呈现明显的剂量依赖关系。

此部分结果表明：双氢中美菊素C能明显抑制LPS诱导Raw264.7的炎症因子及趋化因子水平，具有抗炎调控作用。

(2)DHZD抑制LPS诱导的小鼠原代腹腔巨噬细胞中细胞因子的分泌

1.样品制备

将双氢中美菊素C用二甲基亚砜(DMSO)溶解成100mg/mL，进一步用PBS(磷酸盐缓冲溶液)稀释成40mg/mL的储存液。进一步用无血清的DMEM细胞培养基稀释成为3、5、10、15μM梯度浓度的样品溶液(另配制不含DHZD的0μM样品溶液)；以100ng/mL的脂多糖(LPS)作为细胞水平实验的刺激物。

2.实验方法

1)小鼠原代腹腔巨噬细胞(pMφ)的诱导和培养

腹腔注射SPF级C57BL/6J雌性小鼠(6～8周龄)无菌的3.5％的巯基乙醇酸钠溶液，左右腹各1mL/只。在3.5天后，颈椎脱臼处死小鼠，置75％乙醇中充分浸泡5min消毒。剪开小鼠腹部皮肤，用已吸入预温无菌DMEM的20mL注射器两次冲洗腹腔，将冲洗液收集于无菌50mL离心管中，反复抽吸吹打，1000rpm离心5min，弃上清，用含1％双抗和10％FBS的DMEM培养基重悬，用10mL移液管吹散细胞团块，稀释计数后铺板。常规培养2h后，换液，贴壁细胞即为pMφ。

在pMφ细胞培养基中同时加入LPS(100ng/mL)和不同浓度的DHZD(0～15μM)，作用不同时间点后，收集细胞培养上清。

2)Griess法测定一氧化氮的含量

根据试剂盒说明书步骤操作：①取出Griess Reagent I、II和标准品，使其解冻并恢复室温；②用细胞培养液稀释标准品(1～100μM)；③按50μL/孔在96孔平底板中加入各个标准品及样品(细胞培养上清)；④按50μL/孔在各孔中加入Griess Reagent I试剂；⑤按50μL/孔在各孔中加入Griess Reagent II试剂；⑥轻晃培养板混匀，然后在540nm测定吸光度；⑦根据标准曲线计算出样品中一氧化氮(NO)的浓度。

3.测定及统计方法

分别进行ELISA方法和Griess方法，检测各孔细胞培养上清中炎症因子、趋化因子和NO的分泌情况，各组实验结果采用T检验进行统计学分析，数据用平均数

4.实验结果

实验结果如图2所示：在小鼠原代腹腔巨噬细胞中，DHZD具有抗炎活性，能抑制LPS诱导的促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β和I型干扰素IFN-β以及NO的分泌，降低趋化因子MCP-1和抗炎细胞因子IL-10的分泌。

此部分结果表明：DHZD通过减少促炎细胞因子及趋化因子的产生，下调LPS诱导的巨噬细胞的炎症反应，提示DHZD在细胞水平展现出良好的抗炎活性。

(3)DHZD抑制LPS诱导的树突状细胞中炎症因子的分泌及降低细胞表面共刺激分子的表达

1.样品制备

将双氢中美菊素C用二甲基亚砜(DMSO)溶解成100mg/mL，进一步用PBS(磷酸盐缓冲溶液)稀释成40mg/mL的储存液。进一步用无血清的DMEM细胞培养基稀释成为3、5、10、15μM梯度浓度的样品溶液(另配制不含DHZD的0μM样品溶液)；以100ng/mL的脂多糖(LPS)作为细胞水平实验的刺激物。

2.实验方法

1)小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)的诱导和培养

取SPF级雄性C57BL/6J小鼠(4周龄)双后肢胫骨和股骨共4根骨头，用1mL注射器吸取预温的1640，从骨头两端反复冲洗出骨髓条直至骨头发白，在培养基中用注射器将骨髓条吹散后离心(1000rpm×5min，RT)，弃上清，弹开细胞团块，加入2mL/只破红液，室温破红2.5min，加入等体积含血清的1640中止破红，离心(1000rpm×5min，RT)，弃上清，轻轻弹开细胞团块，加入21mL/只DC完全培养基(10％FBS1640+50ng/mL mGM-CSF+4ng/mL mIL-4)重悬，完全混匀后2.5mL/孔加入六孔板中，在37℃、5％CO

2)流式细胞术(FACS)检测共刺激分子表达情况

①将诱导的小鼠骨髓来源树突状细胞制成单细胞悬液，铺12孔板(5×10

②共孵育24h后，轻柔吹下12孔板各孔细胞，转移至无菌1.5mL Epp管中；

③低温离心，1400rpm，5min；

④弃掉上清，250μL PBS重悬后离心弃上清；

⑤按说明书比例配备死活细胞染液(PBS、Zombie、FcR)，50μL/管，轻轻混匀细胞(RT，避光)10min；

⑥洗一遍：加入Fc Buffer 220μL/管，4℃离心(1400rpm×5min)；

⑦弃上清，纸巾倒扣，加50μL抗体工作液，充分振荡混匀，4℃避光，孵育25min；

⑧洗一遍：加入Fc Buffer 200μL/管，4℃离心(1400rpm×5min)；离心结束后，弃上清，纸巾倒扣，加入PBS200μL，充分振荡混匀，完成收集细胞，准备上机。

3.测定及统计方法

用ELISA方法检测各孔细胞培养上清中炎症因子的分泌情况，用流式检测BMDC表面共刺激分子和MHC II类分子的表达情况，各组实验结果采用T检验进行统计学分析，数据用平均数

4.实验结果

实验结果如图3所示：DHZD能降低LPS诱导的促炎细胞因子IL-6、TNF-α和IL-12p70的分泌，提示DHZD能够抑制LPS诱导的树突状细胞分泌大量的炎症因子；DHZD可以明显抑制共刺激分子和MHC II类分子的表达，提示DHZD能降低树突状细胞活化T细胞的能力。

(4)DHZD单用或与地塞米松联用能提高LPS诱导的脓毒症小鼠的存活率

1.样品制备

将双氢中美菊素C用二甲基亚砜(DMSO)溶解成80mg/mL，进一步用无菌PBS稀释至4mg/mL，另配制地塞米松(DXM)药液；使用12.5mg/kg的LPS诱导脓毒症休克小鼠模型。

2.实验方法

1)小鼠脓毒症休克模型的构建

根据体重将已适应性饲养1周的雌性7周龄C57BL/6J小鼠均匀的分布于各个小组，打耳标记录。分组情况：LPS组、LPS+DXM(5mg/kg)组、LPS+DHZD(10mg/kg,L)组、LPS+DHZD(20mg/kg,M)组LPS+DHZD(40mg/kg,H)组LPS+DXM+DHZD(L)组；共6组，10只/组。造模当天，将LPS用无菌PBS稀释至实验浓度，按预实验摸索最佳致死浓度12.5mg/kg，腹腔注射，构建小鼠脓毒症休克模型，药物同时注射。连续观察180h小鼠的生活状态和存活情况。

3.测定及统计方法

连续观察7天并记录每组小鼠的存活情况和生存状态，用Graphpad prism 8软件绘制生存曲线，采用Log-Rank检验进行生存分析。

4.实验结果

实验结果如图4所示：①12.5mg/kg剂量的LPS成功诱导脓毒症休克小鼠模型，模型组小鼠在40h内全部死亡，且实验过程中小鼠出现嗜睡、战栗、竖毛和发冷的等症状；②阳性药物DXM能有效保护脓毒症休克小鼠，存活率为60％；③10mg/kg的DHZD单独作用有机体保护的趋势，存活率为20％；④20mg/kg和40mg/kg的DHZD单独作用存活率一致，均为30％，与LPS模型组相比有统计学意义；⑤10mg/kg DHZD联合DXM能100％保护脓毒症休克小鼠，保护作用优于DXM单用组，有统计学意义。

此部分结果表明：DHZD对LPS诱导的脓毒症休克模型小鼠具有一定的保护作用，可以延长小鼠生存期，DHZD与DXM联用有更好的协同保护作用。

(5)DHZD减少LPS诱导的小鼠血清中细胞因子的分泌

1.样品制备

将双氢中美菊素C用二甲基亚砜(DMSO)溶解成80mg/mL，进一步用无菌PBS稀释至4mg/mL，另配制DXM药液；使用10mg/kg的LPS诱导急性腹膜炎小鼠模型。

2.实验方法

1)小鼠急性腹膜炎模型的制备

根据体重将已适应性饲养1周的雌性7周龄C57BL/6J小鼠均匀的分布于各个小组，打耳标记录。分组情况：PBS(0.2mL/只)组、LPS(10mg/kg)组、LPS+DXM(5mg/kg)组、LPS+DHZD(40mg/kg)组、LPS+DXM(5mg/kg)+DHZD(10mg/kg)组；共5组，9只小鼠/组。造模当天，将LPS用无菌PBS稀释至实验浓度，按10mg/kg腹腔注射，构建小鼠急性腹膜炎模型，同时分别腹腔注射DHZD和/或DXM药物，12h后取材。

2)小鼠血清样本制备

用左手食指和拇指夹持小鼠头面部皮肤，充分暴露眼球，将小鼠头朝下，眼球对准开口的1.5mL Epp管，用眼科弯镊快速夹住眼球后迅速外拉，将血液全部收集于该1.5mLEpp管中，避免血滴挂壁溶血。于4℃冰箱中静置3h，然后离心(4℃，3500rpm×25min)，吸取上层澄清透亮血清于新的1.5mL Epp管中。

3.测定及统计方法

用ELISA方法检测小鼠血清中细胞因子的分泌情况，各组实验结果采用T检验进行统计学分析，数据用平均数

4.实验结果

实验结果如图5所示：①LPS诱导的急性腹膜炎小鼠IL-6、TNF-α、MCP-1和IL-10的水平明显增加，即感染促进炎症因子和趋化因子的产生；②阳性药物DXM和单独给药DHZD均抑制IL-6、TNF-α、MCP-1和IL-10的产生，具有统计学意义；③DHZD与DXM联合给药大幅降低IL-6、TNF-α、MCP-1和IL-10的产生，其中IL-6较单用阳性药物DXM组抑制作用更明显，具有统计学意义。

此部分结果表明：与DXM单独用药相比，联合用药可以更好的抑制重要的炎症因子的产生。

(6)DHZD对CRKP感染小鼠的体温具有保护作用

1.样品制备

将双氢中美菊素C用二甲基亚砜(DMSO)溶解成80mg/mL，进一步用无菌PBS稀释至4mg/mL，另配制左氧氟沙星(LVX)药液、无效抗生素MEM药液；使用致死剂量的CRKP制备脓毒症休克小鼠模型。

2.实验方法

1)小鼠脓毒症休克模型的构建

根据体重将已适应性饲养1周的雌性7周龄C57BL/6J小鼠均匀的分布于各个小组，打耳标记录。分组情况：PBS组、CRKP(9×10

3.测定及统计方法

连续观察并记录每组小鼠的存活情况和生存状态，用Graphpad prism 8软件绘制生存曲线，采用Log-Rank检验进行生存分析。在造模前和9h后分别用红外测温仪记录小鼠的体温。

4.实验结果

实验结果如图6所示：①CRKP成功诱导脓毒症休克小鼠模型，模型组小鼠在40h内死亡率达90％，且实验过程中小鼠出现嗜睡、战栗、竖毛和发冷的等症状；②阳性药物LVX能有效保护脓毒症休克小鼠，存活率为70％；③无效抗生素MEM对CRKP诱导的脓毒症没有保护作用；④DHZD不能增加致死量的CRKP感染小鼠的存活率；⑤DHZD可以使CRKP感染后的脓毒症休克模型小鼠减缓体温的下降，有利于其维持或恢复正常体温。

此部分结果表明：DHZD对通过感染CRKP构建的脓毒症休克模型小鼠有一定的体温保护作用。

(7)DHZD对CRKP感染小鼠的脏器具有保护作用

1.样品制备

将双氢中美菊素C用二甲基亚砜(DMSO)溶解成80mg/mL，进一步用无菌PBS稀释至4mg/mL，另配制LVX药液；使用6×10

2.实验方法

1)小鼠脓毒症模型的构建

根据体重将已适应性饲养1周的雌性7周龄C57BL/6J小鼠均匀的分布于各个小组，打耳标记录。分组情况：PBS组、CRKP组(6×10

3.测定及统计方法

处死小鼠，取出小鼠的肺脏和肝脏固定在4％的多聚甲醛中，石蜡包埋，并用HE染色，使用PANNORAMIC MIDI II显微镜观察组织病理学改变。根据12分病理量表对肺水肿、肺泡浸润和肺血管炎进行评分，各组实验结果采用T检验进行统计学分析，数据用平均数

4.实验结果

实验结果如图7所示：与PBS组比较，CRKP组小鼠肺组织可见明显的炎性细胞浸润，肺泡内大量液体渗出，肺间质增厚；肝脏可见炎性细胞浸润，肝细胞肿胀坏死，部分细胞核碎裂溶解，肝板结构破坏。DHZD可减轻肺、肝组织损伤。肺组织病理评分(肺水肿、肺泡浸润和肺血管炎)显示DHZD对组织病理损伤具有保护作用。

此部分结果表明：DHZD对通过感染CRKP构建的脓毒症模型小鼠的肺脏和肝脏具有保护作用。

(8)DHZD促进Raw264.7细胞对pHrodo标记E.coli的吞噬作用

1.样品制备

将双氢中美菊素C用二甲基亚砜(DMSO)溶解成100mg/mL，进一步用PBS(磷酸盐缓冲溶液)稀释成40mg/mL的储存液，进一步用无血清的DMEM细胞培养基稀释成为15μM的样品溶液；以100ng/mL的脂多糖(LPS)作为细胞水平实验的刺激物。

2.实验方法

按以下步骤进行巨噬细胞吞噬功能检测实验：

Raw264.7细胞1×10

②24h后，单独加入含LPS(100ng/mL)的新鲜培养基，或加入含LPS(100ng/mL)和DHZD(15μM)的新鲜培养基；

③24h后，加入10μL的pHrodo荧光标记大肠杆菌(E.coli)冻干粉菌液(提前37℃超声振动15min)，37℃无CO

④弃去培养基，用无菌PBS轻柔冲洗96孔板中各孔细胞3次，分别重悬各孔细胞于2％BSA溶液中，随后通过FACS技术检测Raw264.7细胞吞噬pHrodo荧光标记E.coli菌的情况。

3.测定及统计方法

用流式细胞技术检测DHZD干预下巨噬细胞吞噬细菌的功能，各组实验结果采用T检验进行统计学分析，数据用平均数

4.实验结果

实验结果如图8所示：DHZD能显著增加Raw264.7对pHrodo荧光标记E.coli吞噬的数量，提示其能够促进小鼠巨噬细胞对细菌的吞噬作用。

此部分结果表明：DHZD能促进巨噬细胞的吞噬。

(二)制剂

(1)双氢中美菊素C片剂的制备

将10g双氢中美菊素C与87.5g辅料(白湖精:乳糖＝7:3，质量比)混合之后，加入95％的乙醇制粒，干燥，整粒(过筛)，加入硬脂酸钠2.5g混合均匀后压片，每片重200mg，其中双氢中美菊素C的含量为10mg。

(2)双氢中美菊素C粉针剂的制备

将1g双氢中美菊素C与5g甘露醇溶解于170mL的注射用水中，初次混匀之后定容到200mL，过滤所得到的溶液，装入西林瓶中，每瓶1mL，冻干，密封、灭菌，即得到每支含有5mg双氢中美菊素C的冻干粉针剂。

(3)双氢中美菊素C胶囊剂的制备

将15g双氢中美菊素C与135g辅料(白湖精:乳糖＝7:3，质量比)混合之后，加入95％的乙醇制粒，干燥，整粒(过筛)，装入胶囊中，每粒重150mg，其中双氢中美菊素C的含量为15mg。

综上所述，双氢中美菊素C能明显抑制小鼠巨噬细胞Raw264.7在LPS诱导下的细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β、MCP-1和IL-10)的生成，尤其是能抑制脓毒症模型中的试验小鼠血清中的细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α和MCP-1的生成；且提高了脓毒症模型中的试验小鼠的存活率、发挥体温和脏器保护作用。此外，双氢中美菊素C还能抑制树突状细胞表面共刺激分子(CD80、CD86和CD40)和MHC II类分子(Iab)表达，起到抑制T细胞的活化、减少细胞因子风暴的作用，以及促进巨噬细胞对细菌的吞噬。因此，双氢中美菊素C可作为活性成分用于制备抗炎和免疫调节药物，尤其可用于制备治疗脓毒症的抗炎及免疫调节药物，从而减轻脓毒症临床治疗中难以控制的危急症状，具有明显的临床应用价值。