一种基于超高效液相色谱法的人体血浆中替考拉宁浓度的快速测定方法

摘要

本发明涉及高效液相色谱分析检测技术领域，尤其涉及一种基于超高效液相色谱法的人体血浆中替考拉宁浓度的快速测定方法，该测定方法包括以下步骤：步骤1：吸取替考拉宁标准溶液，加入空白血浆中，制作浓度梯度对照品溶液A、B、C、D、E、F，用高效液相色谱法进行检测，得到标准曲线方程；步骤2：采集待测血浆样品及前处理，然后用高效液相色谱法进行检测，计算色谱峰面积；步骤3：将计算的色谱峰面积输入标准曲线方程即可得到待测血浆样品中替考拉宁的浓度。本发明建立的UPLC测定方法操作简便、专属性好，并具有较高的灵敏性和准确性，适用于临床替考拉宁血药浓度的监测，能及时反馈患者体内的替考拉宁血药浓度。

说明书

技术领域

本发明涉及高效液相色谱分析检测技术领域，尤其涉及一种基于超高效液相色谱法的人体血浆中替考拉宁浓度的快速测定方法。

背景技术

替考拉宁(teicoplanin，TEC)作为一种糖肽类抗菌药物，主要用于治疗革兰氏阳性菌感染，包括厌氧菌双梭状芽孢杆菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)等。与万古霉素相比，其疗效相当，皮疹、肾毒性、红人综合征等不良反应发生率低，为首选替代药物，被广泛应用于临床。替考拉宁临床疗效与稳态血药谷浓度密切相关，治疗一般感染时谷浓度≥10mg·L

替考拉宁主要由TA

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供了一种基于超高效液相色谱法的人体血浆中替考拉宁浓度的快速测定方法。以哌拉西林钠为内标,具有分离时间短、分离效率高，更加准确、简单、灵敏和节省试剂等优点。

本发明的技术实施方案是：

一种基于超高效液相色谱法的人体血浆中替考拉宁浓度的快速测定方法，该测定方法包括以下步骤：

步骤1：吸取替考拉宁标准溶液，加入空白血浆中，制作浓度梯度为100.00、40.00、20.00、10.00、5.00、2.50μg·mL

步骤2：采集待测血浆样品及前处理，然后用高效液相色谱法进行检测，计算色谱峰面积；

步骤3：将计算的色谱峰面积输入标准曲线方程即可得到待测血浆样品中替考拉宁的浓度。

作为本发明的一种优选技术方案，替考拉宁标准溶液配制如下：

称取替考拉宁对照品5.00mg，置5mL容量瓶内，加入适量经超声的超纯水溶解后稀释至刻度，反复颠倒摇匀，得1.00mg·mL

更进一步地，步骤1中，标准曲线方程为：Y＝0.0507X+0.0257(R

作为本发明的另一种优选技术方案，步骤2中，待测血浆样品采集与前处理包括以下步骤：

(1)将血液样本经3500rpm下离心25min，取全部上清液分别置于2mL小试管中，冷冻保存；

(2)移液枪吸取血浆样本200μL于EP管中，加入10uL内标溶液经涡旋5s混匀后，再加入乙腈300μL沉淀蛋白，涡旋混合器震荡3min，用高速离心机在12000rpm下离心10min，转移全部上清液于离心管，再加入适量三氯甲烷，涡旋混合器振荡3min，在12000rpm离心15min，取上清液100μL，经0.22um微孔滤膜过滤于进样瓶中，进样分析。

更进一步地，在步骤(1)中，内标溶液是哌拉西林钠内标储备液，其浓度为360μg·mL

更进一步地，在步骤(2)中，三氯甲烷加入量为300μL。

作为本发明的另一种优选技术方案，步骤1和步骤2所用高效液相色谱方法的色谱条件为：

色谱柱：Shim-pack GIST-HP C18；

流动相：0.1％甲酸乙腈-水；

检测波长：240nm；

流速：0.4mL·min

进样量：5μL；

柱温：40℃；

梯度洗脱：0→0.01min，B Conc 18％；0.01→15min，B Conc 18％→35％；15.0→15.01min，B Conc 35％→90％；15.0→20.0min，B Conc 90％；20.00→20.01min，B Conc90％→18％，25min stop。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明建立的UPLC测定方法操作简便、专属性好，并具有较高的灵敏性和准确性，适用于临床替考拉宁血药浓度的监测，能及时反馈患者体内的替考拉宁血药浓度，为临床制定个体化给药方案提供参考。

2、本发明通过准确度及精密度试验结果表明测定方法的精密度RSD<5％，准确度均在90％～100％之间，具有良好的精密度，准确度高。

附图说明

图1为替考拉宁及内标哌拉西林色谱图；A–空白血浆，B–空白血浆+替考拉宁标准品，C–空白血浆+内标，D–空白血浆+内标+替考拉宁标准品。

图2为血清中替考拉宁测定标准曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

研究方法与结果

1、UPLC色谱条件

色谱柱：Shim-pack GIST-HP C18(100mm×2.1mm,3μm)；

流动相：0.1％甲酸-水(A)、0.1％甲酸-乙腈(B)；

检测器：光电二极管阵列检测器(PDA)；

检测波长：240nm；

流速：0.4mL·min

进样量：5μL；

柱温：40℃；

梯度洗脱流程：0→0.01min，B Conc 18％；0.01→15min，B Conc 18％→35％；15.0→15.01min，B Conc 35％→90％；15.0→20.0min，B Conc 90％；20.00→20.01min，BConc 90％→18％，25min stop；

2、溶液的配置

标准品溶液：精密称取替考拉宁对照品5.00mg，置5mL容量瓶内，加入适量经超声的超纯水溶解后稀释至刻度，反复颠倒摇匀，得1.00mg·mL

内标物溶液：精密称取哌拉西林钠对照品1.80mg，置5mL容量瓶内，加甲醇溶解后稀释至刻度，反复颠倒摇匀，得360μg·mL

3、样品采集及前处理方法

随机选取本院健康志愿者的血液样本，经3500rpm下离心25min，取全部上清液分别置于2mL小试管中，冷冻保存。血液采集前经志愿者同意，并签署知情同意书。此外，该实验设计和实施方案均得到延边大学附属医院医学伦理委员会同意。

移液枪吸取血浆样本200μL于1.5mL EP管中，加入10uL内标溶液经涡旋5s混匀后，再加入乙腈300μL沉淀蛋白，涡旋混合器震荡3min，用高速离心机在12000rpm下离心10min，转移全部上清液于离心管，再加入300μL三氯甲烷，涡旋混合器振荡3min，在12000rpm离心15min，取上清液100μL，经0.22um微孔滤膜过滤于进样瓶中，进样分析，进样量5uL。

4、方法学验证

4.1专属性

分别取出200μL健康人群血清4份，作为空白血浆、空白血浆加内标、空白血浆加替考拉宁，空白血浆加内标与替考拉宁，处理血样后进样分析，观察色谱图，如图1所示，替考拉宁主峰(取其主要组分TA

4.2标准曲线

吸取第2小节下替考拉宁标准溶液30μL，加入空白血浆270μL，配制成浓度为100μg·mL

4.3检测线与定量下限

取出第2小节下替考拉宁储备液和健康人群血清，配制替考拉宁浓度为2.50、1.00、0.50、0.25、0.10、0.50μg·mL

4.4准确度及精密度试验

吸取第2小节下的替考拉宁标准溶液85μL，加入空白血浆765μL，配制成浓度为100μg·mL

表1准确度试验结果(n＝5)

表2日内精密度实验结果(n＝5)

表3日间精密度实验结果(n＝5)

4.4稳定性试验

取第2小节下的替考拉宁标准溶液，用健康人群血清稀释配制成浓度为40.00、10.00、5.00μg·mL

表4室温稳定性试验结果

表5冻融稳定性试验结果

4.5提取及方法回收率

取替考拉宁标准溶液，分别用健康人群血清与甲醇稀释配制成浓度为40.00、10.00、5.00μg·mL

表6提取及方法回收率实验结果(n＝5)

3讨论

3.1流动相体系的选择

磷酸盐缓冲体系流动相,长时间使用会导致色谱柱堵塞,需在样品分析后长时间的清洗仪器，于是我们对流动相进行优化,通过不断调节甲酸在乙腈-水体系中的比例，结果发现，0.1％甲酸乙腈-水体系为流动相时，替考拉宁的5个主要峰分离良好，缩短保留时间，消除拖尾，有利于替考拉宁血药浓度的检测。

3.2梯度洗脱条件的选择

替考拉宁组分多，结构复杂，采用梯度洗脱才能快速有效分离，通过观察实验结果发现,梯度越大,替考拉宁出峰时间越早,哌拉西林出峰时间越晚。最后

经过多次试验，确定梯度为B con％＝18-35％时,各组分可以很好分离。哌拉西林保留时间适宜,出峰时间在其他组分出峰之后,且峰形较好。

3.3血浆样品预处理溶剂的选择

替考拉宁稳定性好，极性大，需选择合适的萃取试剂。文献报道中多为乙腈沉淀蛋白，二氯甲烷或氯仿萃取。本实施例考比较二氯甲烷与氯仿的萃取效果，发现用氯仿萃取样品的分离度比二氯甲烷更优。其次比较200μL、300μL、400μL氯仿对替考拉宁萃取效果，结果发现，采用300μL氯仿萃取萃取最佳。所以本研究最终选择300μL氯仿作为液-液萃取有机溶剂。

综上所述，本研究建立的UPLC测定方法操作简便、专属性好，并具有较高的灵敏性和准确性，适用于临床替考拉宁血药浓度的监测，能及时反馈患者体内的替考拉宁血药浓度，为临床制定个体化给药方案提供参考。