鉴定五叶草莓的KASP分子标记组及其应用

摘要

本发明涉及分子生物技术领域，具体公开了鉴定五叶草莓的KASP分子标记组及其应用，KASP标记组包括A07A2327328、A07G2331369和A07C2368466，引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.3所述的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO.4‑SEQ ID NO.6所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.7‑SEQ ID NO.9所示的引物对。本发明的KASP分子标记组及其引物对能够快速、稳定地筛选和鉴定五叶草莓种质资源，显著区分五叶草莓资源，有效加速遗传多样性和遗传结构分析。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及鉴定五叶草莓的KASP分子标记组及其应用。

背景技术

目前，分子标记筛选方法发展迅速，全基因组关联分析(Genome-WideAssociation Study，GWAS)为近年来逐渐发展起来的一种研究全基因组中的变异序列和表型间关联性的分析方法，可以分析SNP(单核苷酸多态性)的等位频率是否与表型性状值有关联，以定位导致个体之间出现表型变异的基因或基因组区域，进而筛选出与复杂性状表现型变异相关联的分子标记。GWAS研究能够充分利用群体进化过程中数千世代发生的重组事件，通过打破连锁不平衡或者一段染色体区域内多态性位点的相关性来增加定位效率，以简单易行高通量等优点成为基因组学研究的热点。

SNP分子标记在整个基因组中数量多，高密度分布，灵敏度高，突变频率较低，易于基因分型，是目前最具潜力的分子标记。它是一种二态性标记，单个标记位点的区分能力较弱，需要结合多个特异位点组合形成特定指纹区分品种，要求高通量检测平台。SNP作为一种广泛存在动植物体内的遗传标记，对于遗传变异连锁作图、群体分析以及关联分析工作开展有着很大的作用。竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele-specific PCR，KASP)技术是近些年来发展起来的一种主要基于SNP的高通量基因分型技术。该技术由于其高通量、低成本和可操作性强等优点而在农作物性状遗传改良研究领域备受关注。目前，KASP分子标记已广泛应用于甜椒、小麦、大豆等作物中，主要用于构建遗传图谱、种质资源鉴定等方面，但在草莓中应用的还鲜有报道。

中国是世界野生草莓资源最丰富的国家，分布有草莓属26个种中的15个，包括10个二倍体和5个四倍体种类。野生草莓种类众多，表型多样性丰富，一些野生草莓资源在形态上难以区分，并且植株的表型性状还会受生态环境条件影响而产生变异。五叶草莓(Frageria pentaphylla Losinsk.)是原产与我国的特有二倍体种，广泛分布于以秦巴山区为中心的四川、陕西、甘肃等地，多生长于海拔700～2300m的山坡草地，抗病性、抗涝性与其他二倍体野生草莓资源相比较强，其果实颜色、大小、品质、香味、以及叶片、匍匐茎、植株等方面变异较大，具有广泛的遗传多样性。传统的种质资源鉴定方法主要基于形态性状调查，但是中国野生草莓资源丰富，不同野生种分布区域重合，很难区分这些资源种类；而且，五叶草莓本身分布范围广泛且形态性状变异丰富，传统种质资源鉴定方法耗时、耗力，这也成为如何提高种质资源鉴定效率的瓶颈之一。因此，筛选出能鉴别五叶草莓的分子标记尤为重要。

发明内容

为丰富鉴别五叶草莓的分子标记，本发明提供了鉴定五叶草莓的KASP分子标记组及其应用，本发明提供的KASP分子标记组的引物对能够快速、稳定地筛选和鉴定五叶草莓种质资源，显著区分五叶草莓资源，有效加速遗传多样性和遗传结构分析。

本发明提供了鉴定五叶草莓的KASP分子标记组，所述五叶草莓的KASP分子标记组为A07A2327328、A07G2331369和A07C2368466中的任意一个或多个的组合；

所述分子标记A07A2327328的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示；

所述分子标记A07G2331369的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6所示；

所述分子标记A07C2368466的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.9所示。

本发明还提供了一种芯片，包括上述的分子标记A07A2327328的引物对、分子标记A07G2331369的引物对和分子标记A07C2368466的引物对中的任意一组。

本发明还提供了一种检测试剂盒，包括上述的分子标记A07A2327328的引物对、分子标记A07G2331369的引物对和分子标记A07C2368466的引物对中的任意一组。

进一步地，所述引物对为粉末固态或者液态。

本发明还提供了利用上述鉴定五叶草莓的KASP分子标记组对五叶草莓种质资源进行基因分型的方法，包括如下步骤：

S1，以五叶草莓的DNA为模板，利用任意一个KASP分子标记的引物对进行PCR扩增；

S2，读取荧光值并处理：读取PCR扩增后体系的荧光值，将数据荧光值进行标准化处理，获取每一个PCR扩增后体系的VIC和FAM对应的相对荧光值，根据相对荧光值，对样品进行聚类分簇，根据样品簇和荧光类型确定基因型；

S3，基因分型验证：在不同二倍体野生草莓资源上进行基因分型验证，筛选出目的分子标记和引物对。

进一步地，S2中，利用LGC_OMEGA的基因型读取软件对读取的荧光值结果数据进行分析，利用Douglas的基因型读取软件绘制的基因分型数据。

本发明还提供了所述的KASP分子标记组在鉴定野生草莓种质资源中的应用。

进一步地，所述野生草莓种质资源种类包括五叶草莓、中国草莓、西藏草莓、黄毛草莓、峨眉草莓、东北草莓、绿色草莓、森林草莓。

进一步地，所述野生草莓种质资源鉴定结果判断标准为：

对于分子标记A07A2327328，若检测位点基因型为T/T或A/T(T/A)，则该野生草莓种质资源鉴定为五叶草莓；

对于分子标记A07G2331369，若检测位点基因型为A/A或A/G(G/A)，则该野生草莓种质资源鉴定为五叶草莓；

对于分子标记A07C2368466，若检测位点基因型为T/T或T/C(C/T)，则该野生草莓种质资源鉴定为五叶草莓。

本发明还提供了所述的芯片或检测试剂盒在在鉴定野生草莓种质资源中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供了一种基于GWAS分析和SNP技术开发的用于五叶草莓种质资源鉴定的核心KASP分子标记A07A2327328、A07G2331369和A07C2368466。能够快速、准确、有效地鉴定评价草莓种质资源材料。不受环境、季节及基因的表达限制，从五叶草莓植株苗期便可进行鉴定。可以解决因大量种质积累而带来的资源冗余、保存管理不便以及知识产权纠纷等问题。为五叶草莓遗传图谱构建、基因定位、分子辅助育种等提供分子标记，为建立标准化、高通量、低成本的分子检测技术平台奠定了良好基础。

2、本发明提供了一种快速、有效、稳定地鉴定五叶草莓种质资源的方法，只需通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、KASP基因分型检测即可完成对样品的鉴别；不需要限制性内切酶酶切，标记的特异性强、稳定性高，并且标记的筛选方法操作简便快捷具有试验试剂用量少、速度快、成本低、适合大批次、高通量、自动化的优点，非常适合现代农业分子育种的实现。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中的KASP分子标记A07A2327328的分型图。

图2为本发明中的KASP分子标记A07G2331369分型图。

图3为本发明中的KASP分子标记A07C2368466分型图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：鉴定五叶草莓的KASP分子标记组的筛选。

一、获取五叶草莓基因组DNA

以五叶草莓嫩叶为材料，采用改良CTAB法提取基因组DNA。具体步骤如下：

1、将嫩叶在液氮中研磨成粉，迅速装进灭菌的2mL离心管中，暂存于液氮。

2、水浴锅预热至65℃，预热600μL 2％ CTAB及2μLβ-琼脂乙酸。

3、将粉末快速与溶液混合，摇匀，65℃水浴30min，每隔5min取出摇一摇，最后5min常温静止。

4、4℃，10000rpm离心10min，准备新的离心管，吸取上清液，加入612μL氯仿异戊醇(24:1)，并在室温条件下震荡混匀5min。

5、4℃，10000rpm离心10min，准备新的离心管，吸取上清液250μL加30μL NaAc及二倍体积500μL的冰乙醇-80℃沉降2h(或-20℃沉降过夜)。

6、取出沉降好的DNA，10000rpm离心10min，将500μL上清液弃置，留下沉淀。

7、在沉淀中加入75％乙醇500μL吸打混匀，8000rpm离心3min。

8、弃上清，加500μL100％冰乙醇，吸打混匀，8000rpm离心3min。

9、吸干管内残余液体，加入45μL ddH

10、检测浓度，将DNA统一稀释到10ng/μL，-20℃储存。

11、DNA浓度检测：随机抽取若干个DNA工作液，使用NanoDrop 2000测浓度，将DNA原液稀释至10ng/μL。

二、野生草莓自然群体的全基因组关联分析(GWAS)

利用广泛收集的野生草莓种质材料为自然群体，通过对其表型观察及记录，对118份野生草莓进行全基因组重测序，结合前期表型数据，开展全基因组关联分析，开发性状相关分子标记。基于重测序，通过测序数据质控、序列比对分析，共获得830,537个SNP。

三、SNP位点筛选

结合全基因组SNP标记和野生草莓种质资源表型调查数据，利用gemma软件中的MLM(QK)模型，将Admixture最优K值对应的群体结构矩阵作为相应模型的Q矩阵，gcta软件计算的样品间的亲缘关系矩阵作为相应模型的K矩阵，进行关联性分析。在阈值为0.05时，共有117个SNP可能与五叶草莓种质资源鉴定相关，其中8个位于1号染色体上，16个位于2号染色体上，18个位于3号染色体上，12个位于4号染色体上，16个位于5号染色体上，19个位于6号染色体，28个位于7号染色体上，以50kb作为注释区间大小，包含候选基因1563个。

四、开发五叶草莓KASP标记

根据GWAS结果，选取SNP位点开发标记成KASP标记。将选择的序列与二倍体森林草莓基因组进行比对，选择评估合格的序列开发KASP标记。基于上述结果，根据SNP标记的染色体位置、侧翼序列等具体信息，选择20条SNP序列进行KASP标记开发与设计，只有引物设计成功的SNP位点才认为是合格的KASP标记，使用合格的KASP标记进行后续的验证及分析。

五、KASP基因分型

按照实施例1的方法提取五叶草莓幼嫩叶片组织全基因组DNA，备用。

1、引物稀释

将引物干粉稀释到100μL/mL，再将三条序列按照F1：F2：R：水＝24：24：48：100的比例进行稀释。

2、DNA稀释

将DNA统一稀释到10ng/μL。

3、PCR反应体系

PCR反应体系如表1所示。

表1 PCR反应体系

4、PCR扩增体系

SNP位点检测使用一组包括两个温度步骤的热循环条件，而不是传统的三个步骤。在本发明中，DNA在较高的温度下变性，然后在一个较低的相同温度退火和延伸。具体PCR热循环条件下表所示。PCR热循环扩增可在任何合适的PCR基因扩增仪上进行，PCR扩增体系如表2所示。

表2 PCR扩增体系

5、荧光值读取

PCR扩增循环结束后，在低于40℃的环境下，利用荧光定量PCR仪器读取荧光值。在本方法中，SNP位点检测使用荧光团FAM和VIC来区分两个等基因位点。被动参比染料ROX(passive reference dye ROX)用于校正孔与孔之间由于反应体积误差导致的信号差异。相关的激发和发射波长示于下表3中。读取软件为LGC的oemga设备。荧光值读取波长见表3。

表3荧光值读取波长

注：如果荧光扫描仪器将HEX荧光基团作为检测信号，则不需要对设置进行修改，因为VIC和HEX的激发光和发射光值非常相似。

6、数据分析和基因型数据获取

(1)Douglas基因分析结果说明

利用Douglas的基因型读取软件对5中荧光值读取的结果数据进行分析。在该软件中，VIC和FAM数据分别绘制在x轴和y轴上。每个反应孔的VIC和FAM值通过该特定孔参比染料(ROX)的值进行矫正，将数据荧光值进行标准化处理，获取每一个PCR反应孔(PCR扩增后体系)的VIC和FAM对应的相对荧光值。根据相对荧光值，对样品进行聚类分簇，进一步根据样品簇和荧光类型确定基因型。

Douglas的基因型读取软件绘制的基因分型数据。标记为红色的基因型样品对于VIC标记的等位基因是纯合的，标记为蓝色的基因型样品对于FAM标记的等位基因是纯合的，标记为绿色的样品为杂合。

(2)LGC_OMEGA基因分析结果说明

利用LGC_OMEGA的基因型读取软件(Kluster Caller)对上述荧光值读取的结果数据进行分析。在该软件中，VIC和FAM数据分别绘制在x轴和y轴上。每个反应孔的VIC和FAM值通过该特定孔参比染料(ROX)的值进行矫正，将数据荧光值进行标准化处理，获取每一个PCR反应孔的VIC和FAM对应的相对荧光值。根据相对荧光值，对样品进行聚类分簇，进一步根据样品簇和荧光类型确定基因型。

7、SNP分子标记基因分型验证

根据SNP标记的染色体位置、侧翼序列等具体信息，选择20个SNP进行KASP标记开发与设计。利用筛选获得的KASP标记在不同二倍体野生草莓资源上进行基因分型验证，包括五叶草莓19份(表4)、中国草莓11份、西藏草莓7份、黄毛草莓10份、峨眉草莓2份、西南草莓2份、东北草莓2份、东方草莓1份、绿色草莓1份以及森林草莓5份。检测结果表明，A01A14996061、A02T5689852、A02C13417736等11个KASP分子标记在60份样本中分型成功，其余9个标记分型结果不具差异性，并舍弃。最终锁定3个SNP分子标记的KASP引物与五叶草莓种质资源鉴定相关(表5)。每个SNP分子标记的位点碱基类型及其上下游序列见表6。

表4 19份五叶草莓种质资源

表5五叶草莓种质资源鉴定相关SNP分子标记及KASP引物

SEQ ID NO.1:

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCATTCCCAAAGGCATACT；

SEQ ID NO.2:

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCCATTCCCAAAGGCATACA；

SEQ ID NO.3:CCTAAGGAATTTACGGCATCTCA；

SEQ ID NO.4:

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACATACCCAAGTTCTTCCGTCA；

SEQ ID NO.5:

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATACCCAAGTTCTTCCGTCG；

SEQ ID NO.6:TTCAATACCAAATCCTCTTTACTGTG；

SEQ ID NO.7:

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACATGGTCTGGCCCACCA；

SEQ ID NO.8:

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATGGTCTGGCCCACCG；

SEQ ID NO.9:AACATGGCTCCTAACGGGTCT。

表6每个SNP标记位点碱基类型及其上下游序列

对目标基因开发的KASP分子标记检测结果如图1-图3所示，图中的横坐标均为FAM标记的荧光强度，纵坐标为VIC标记的荧光强度。分别区分同一位点里不同的SNP基因型，左上端和右下端的都是单道荧光值比较高的，可以认为是不同SNP的纯合子，中间的是两种基因型都存在的杂合子。

实施例2：鉴定五叶草莓的KASP分子标记在五叶草莓种质资源鉴定中的应用。

利用上述获得的KASP分子标记及其引物对五叶草莓种质资源进行鉴定。

一、待测样本

本实施例中的60个待测的野生草莓样品(野生草莓种质资源)信息如表7所示。

表7 60份野生草莓种质资源

二、鉴定过程

1、提取五叶草莓幼嫩叶片DNA

以五叶草莓嫩叶为材料，采用改良CTAB法提取基因组DNA。具体步骤见实施例1。将DNA统一稀释到10ng/μL。

2、引物稀释

将引物干粉稀释到100μL/mL，再将三条序列按照F1：F2：R：水＝24：24：48：100的比例进行稀释。

3、PCR及实时荧光定量检测

按照实施例1中的表2的反应体系和表3的扩增程序进行PCR。

4、荧光值读取

按照实施例1中记载的方法进行荧光值读取。

5、数据分析和基因型数据获取

按照实施例1中记载的方法进行数据分析和基因型数据获取。

三、实验结果

检测结果如表7所示。

表7野生草莓种质资源鉴定结果

注：表中“-”为未检测出结果。

由以上结果可以得到；

对于标记A07A2327328-A/T，若检测位点基因型为T/T或A/T(T/A)，则该野生草莓种质资源鉴定类别为五叶草莓；

对于标记A07G2331369-A/G，若检测位点基因型为A/A或A/G(G/A)，则该野生草莓种质资源鉴定类别为五叶草莓；

对于标记A07C2368466-T/C，若检测位点基因型为T/T或T/C(C/T)，则该野生草莓种质资源鉴定类别为五叶草莓。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。