栽培イチゴにおけるゲノム特異的DNAマーカーの開発と品種識別技術への応用

摘要

栽培イチゴは高次倍数体（八倍体）で，ゲノム構成も未だ解明されておらず，マーカー解析や遺伝解析，またこれに基づく効率的育種の実施が困難である．そのため，栽培イチゴでは他作物に比べこれらの研究が大きく遅れを取っている．そこで著者は，複数ゲノムの複合体であるとされる八倍体イチゴゲノムのうち，単一ゲノムのみを特異的に検出するゲノム特異的（DNA）マーカーの作出を試み，ゲノム構成解明の一助となることを目的に本研究を実施した． 第Ⅱ章第2節では従来法に従って共優性マーカーであるCAPSマーカーを開発したが，倍数体においてこれらはゲノム非特異的であり，実質的には優性マーカーと同等であることが明らになった．第3節では，開発したゲノム非特異的マーカーをゲノム特異的マーカーに改変するため，同祖遺伝子群のクラスター分析を利用してプライマーの再設計を行った．その結果，二倍体ゲノムに特異的と推測されるマーカーが得られた．第4節では，自殖・交配系統を用いて，これらのマーカーの遺伝様式を解析し，大部分のマーカーがdisomic遺伝することから，推測どおり二倍体ゲノム特異的マーカーであることを確認した．また，polysomic遺伝を示唆する遺伝様式が全く見られなかったことから，八倍体イチゴゲノムはAAA’A’BBB’B’（完全複二倍体）に近い構成をとっていると推測された． 第5節では，Fragaria属野生種におけるゲノム特異的マーカーの増幅の有無を調査することにより，栽培イチゴを構成する個々のゲノムが由来する祖先種の探索を試みた．その結果，F.vescaが最低一組のゲノム祖先種であるという従来の知見と一致したが，その他の祖先種は供試種には見られなかった． 2001年頃，栄養繁殖性であるイチゴが無断増殖され，品種育成者の許可を得ずに栽培，流通されているという事態が懸念され始めた．特に海外から輸入されたイチゴの中に，公的機関育成の‘さちのか’や‘とちおとめ’が混入している疑いが強く，事実であれば国内のイチゴ生産者にとって著しい不利益となる．このため，「育成者権侵害」を立証できるDNA品種識別法の開発が強く望まれていた． そこで著者らは，第Ⅱ章で開発した25のDNAマーカーを利用して品種識別技術の確立を試みた．第Ⅲ章第2節では，これらのマーカーを用いることで，突然変異系統を除く117品種が識別可能であることを明らかにした． 品種検出技術の再現性を保証するには，適正な試験に基づいて，感度・特異性を明示する必要がある．第3節では，AOAC Internationalの指定する定性分析法の妥当性確認試験基準を参考に，研究室間共同試験を実施し，ほぼ全てのマーカーで感度・特異性共に95%以上という良好な再現性を確認した．再現性の保証された品種識別技術は農作物では初めてである． またDNA品種識別には，常に，偶然に，全てのDNA多型が一致する他品種が存在する可能性，つまり誤判定の危険性を考慮しなければならない．そこで第4節では，品種同定理論（鵜飼，2004）に基づき，相互独立なマーカーを選出した上で，解析した全品種（125品種）の多型データから各マーカーの多型頻度を算出し，危険率を明示した．この結果，16マーカーを用いることで約99．9%の確率で品種判定が可能であることを示した． 最後に第5節において，2003年春に量販店より購入された韓国産‘女峰’イチゴについて本識別技術での分析を試みたところ，‘さちのか’と‘レッドパール’の混合であることが立証された．%Analyses performed in octoploid F. × ananassa (strawberry) by using DNA markers and Mendelian predictions are confounded by the complex and incompletely understood genetic constitution of this species. Therefore, the breeding with genome analysis of F. × ananassa lags far behind other major crops.rnIn this study we tried to develop genome-specific DNA markers which can detect a single genomic locus among multiple homoeologous genomes in F. × ananassa, in order to clarify the genetic constitution of F. × ananassa.rnIn chapter II, section 2, we explain how we developed Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) markers in the usual way, and we show that they are non-genome-specific and are treated as dominant markers in practical analyses. In section 3, we describe how homoeologous genes amplified by PCR from the octoploid genome were divided into clusters based on their sequences, and primers with cluster-specific sequences were designed to improve the CAPS markers to make them genome-specific. Markers that seemed to be genome-specific were obtained. In section 4, we show how we investigated the inheritance of these improved markers, and we demonstrate that the manner in which they are inherited best suits the model of disomic Mendelian inheritance. Therefore, as expected, the improved markers were proven to be genome-specific. Moreover, the lack of detection of polysomic inheritance in any of the developed markers implied that F. × ananassa is a highly diploidized octoploid (AAA'A'BBB'B').rnIn section 5, we describe how a search for ancestral species that could have donated a genome to F. × ananassa was performed by detecting genome-specific markers in Fragaria species. At least one genome was thought to be derived from F. vesca. No other ancestral genomes were found among the species tested.rnThe unregulated propagation and distribution of patented domestic strawberry cultivars was first suspected as a serious problem in 2001. Fresh strawberries had been imported from other Asian countries. However, there were strong suspicions that cvs. 'Sachinoka' and 'Tochiotome' might have been mixed with imported strawberries. If these cultivars were imported, the rights of breeders have been infringed, thus inflicting economic damage on domestic producers. In light of these concerns, the development of a practical technique for identifying strawberry cultivars is required.rnIn chapter III, section 2, we show how we tested the utility of the 25 markers we developed in chapter II for cultivar identification and confirmed their ability to distinguish among 117 cultivars, except for mutator strains.rnValidation of the genome-specific markers as a regulatory tool rests on the reproducibility of the technique as measured by sensitivity and specificity. In section 3, we explain how we performed a collaborative study according to the criteria which the AOAC International has established for qualitative analyses, and we show the high sensitivity and specificity of over 95% for most markers. This is the first report of a technique for cultivar identification with a reproducibility assured through collaborative study.rnA false positive could possibly result from the accidental generation of a cultivar which has a completely identical genotype as one of the patented cultivars. In section 4, we describe how we calculated the probability of such an event based on the frequency of each genotype detected by independent markers (Ukai, 2004. Theory of cultivar identification). The theoretical accuracy of identification is about 99.9% with 16 independent markers.rnAs a practical test of the methodology, we show the example that imported strawberries from South Korea which were labeled 'Nyoho', were found to be a mixture of cvs. 'Sachinoka' and 'Redpearl', in section 5.