一种斑马鱼癌因性疲乏症模型建立的方法

摘要

本发明涉及药物评价领域，为解决现有技术下癌因性疲乏症动物模型中化疗药物剂量难以控制，实验动物累积毒性较多易死亡，并且造模时间长、通量小、操作困难的问题，公开了一种斑马鱼癌因性疲乏症模型建立的方法，包括如下步骤：选取受精后4天的正常发育的斑马鱼，置于微孔板中，将斑马鱼分为正常对照组和模型组，模型组的斑马鱼通过静脉注射酒石酸长春瑞滨注射液，正常对照组不作处理；正常对照组和模型组在斑马鱼培养液中恒温培养；比较对照组和模型组斑马鱼的总运动距离，模型组总运动距离显著少于正常对照组，则斑马鱼癌因性疲乏症成功建立。该模型建立所需时间短，操作简单，可以高效、高通量实现对药物抗癌因性疲乏症效果的评价。

说明书

技术领域

本发明涉及药物评价领域，尤其涉及一种斑马鱼癌因性疲乏症模型建立的方法。

背景技术

癌因性疲乏(cancer-related fatigue，CRF)是癌症患者中最常见的症状之一，很多报告中均指出，30％-60％的癌症患者在治疗期间会出现中度至重度疲劳，甚至在某些情况下，会导致癌症治疗中断。癌因性疲乏持续时间长，并且对工作、情绪和日常生活产生很大的影响，导致治疗期间和治疗后的整体生活质量受损。患者会出现的症状有乏力、嗜睡、情绪不佳、虚弱、记忆力衰退等，并且癌因性疲乏不能通过休息得到缓解。国内外对癌因性疲乏进行了大量的研究，但是对其生理病理机制以及其有效的治疗手段依然不是特别清楚，因此建立癌因性疲乏的动物模型，用于研究癌因性疲乏的机制以及相关药物筛选是非常重要的。

癌因性疲乏的动物模型至今都没有一个标准的造模方法。目前常见的癌因性疲乏模型主要是大、小鼠模型。如Sorensen等人选取6周的雄性BALB/c小鼠作为造模对象，通过向小鼠腹腔内注射奥沙利铂建立癌因性疲乏症模型，Loman等人通过对7～8周的雌性BALB/c小鼠的腹腔多次注射紫杉醇进行造模。上述小鼠模型需要多次注射抗生素类、抗代谢类、生物碱类、烷化剂类、细胞毒类等化疗药物来完成造模，因为小鼠体型小，化疗药物剂量难以控制，易对小鼠造成过多累积毒性导致其死亡。并且大小鼠模型在研究过程中存在一定的局限性，比如通量小、速度慢、操作困难等。

发明内容

本发明为了克服现有技术下癌因性疲乏症动物模型中化疗药物剂量难以控制，实验动物累积毒性较多易死亡，并且造模时间长、通量小、操作困难的问题，提供一种斑马鱼癌因性疲乏症模型建立的方法，该模型建立所需时间短，操作简单，可以高效、高通量实现对药物抗癌因性疲乏症效果的评价。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种斑马鱼癌因性疲乏症模型建立的方法，包括如下步骤：

A、选取受精后4天的正常发育的斑马鱼，置于微孔板中，将斑马鱼分为正常对照组和模型组，模型组的斑马鱼通过静脉注射酒石酸长春瑞滨注射液，正常对照组不作处理；

B、正常对照组和模型组在斑马鱼培养液中恒温培养；

C、比较对照组和模型组斑马鱼的总运动距离，模型组总运动距离显著少于正常对照组，则斑马鱼癌因性疲乏症成功建立。

本发明将斑马鱼作为模式生物，并选用酒石酸长春瑞滨诱导斑马鱼产生癌因性疲乏。酒石酸长春瑞滨是一种抗肿瘤药，在治疗过程中，会造成神经毒性反应、血液系统毒性从而导致患者发生疲劳。本发明在造模过程中采用单次注射造模，对斑马鱼造成的累积毒性相对较小且可控。培养后模型组斑马鱼的总运动距离比正常对照组有明显减少，减少具有统计学意义(p<0.05)时，说明模型建立成功。

作为优选，所述步骤A的模型组中，酒石酸长春瑞滨注射液的注射量为1-20ng/尾。

为减小注射难度，可在注射前向微板中滴入麻醉剂。

作为优选，所述步骤B中，斑马鱼胚胎培养液包括5mmol/L NaCl、0.17mmol/L KCl、0.4mmol/LCaCl

作为优选，所述步骤B中正常对照组和模型组在26-28℃下培养6-44h。

作为优选，所述步骤C中使用行为分析仪测定斑马鱼的总运动距离。

作为优选，所述步骤C中行为分析仪设定灵敏度Max参数为28-32。

作为优选，所述步骤C还包括测定正常对照组和模型组斑马鱼的ATP含量。

癌因性疲乏症还会导致ATP含量下降，因此本发明还通过斑马鱼的ATP含量评价斑马鱼的癌因性疲乏程度。

斑马鱼癌因性疲乏症模型在评价药物抗癌因性疲乏症效果中的应用。

作为优选，所述应用包括如下步骤：

(1)将模型组随机分为模型对照组和药物组，正常对照组、模型对照组和药物组斑马鱼培养液中26-28℃培养6-44h，其中药物组的斑马鱼培养液中还包括待测药物；

(2)检测并比较各组斑马鱼的总运动距离与ATP含量。

当模型对照组总运动距离和ATP含量比正常对照组有明显减少，减少具有统计学意义(p<0.05)，并且药物组总运动距离和ATP含量均比模型对照组有明显增加，增加具有统计学意义(p<0.05)，说明药物有抗癌因性疲乏症的效果；当药物组总运动距离和ATP含量与模型对照组相比，没有明显增加时，说明药物不具有抗癌因性疲乏症的效果。

因此，本发明对癌因性疲乏模型建立提出了一种新的方法，同时该模型在癌因性疲乏机制研究以及对癌因性疲乏的治疗有着重要的意义。与哺乳动物模型相比，本发明模型具有以下优点：1)药物造成的副作用相对较小——由于大小鼠造模时需要多次、长时间注射化疗药物来完成造模，所以多次注射的操作行为带来的惊恐反应、累积的药物副作用不容忽视；斑马鱼为单次注射造模，注射前在水中滴入麻醉剂，注射操作对斑马鱼无明显影响，且化疗药物造成的累积副作用相对较小；2)短时高效——本模型可在6-24h内建立，完成药效学评价仅需26-44h实验周期短；且斑马鱼因为体型较小，可以在能够在一个标准的6、12、24、48或96孔板内进行分析，使斑马鱼成为一种能进行高通量自动化体内药物致敏性评价的理想模型；3)操作简易——大小鼠的CRF模型造模时间至少在3周以上，并且药物需要多次注射进行造模；本发明中，斑马鱼仅需1次注射，且注射后6-24h模型即可成功建立。

具体实施方式

下面结合具体实施方法对本发明做进一步的描述。

实施例1

斑马鱼癌因性疲乏症模型的建立：

A、注射量的确定

(1)取5对斑马鱼亲本交配，按照Westerfield的方法孵化胚胎，将受精后4天的斑马鱼置于解剖显微镜下观察，挑取发育正常的斑马鱼移入6孔微孔板中，每孔放30尾斑马鱼，每孔容量为3mL；

(2)将斑马鱼分为正常对照组和模型组，模型组的斑马鱼通过静脉注射酒石酸长春瑞滨注射液，注射量为1-20ng/尾，正常对照组不作处理；

(3)正常对照组和模型组在斑马鱼培养液中28℃恒温培养24h，取出斑马鱼，利用行为分析仪(Zebra Lab 3.22.3.31，Viewpoint，法国)测定斑马鱼的总运动距离，结果如表1所示。

表1.不同注射量下斑马鱼的总运动距离

与正常对照组比较，**p<0.01，***p<0.001。

由表1数据可知，注射量在1-2ng/尾时，斑马鱼的存活率较高，并且总运动距离显著下降，因此选用1-2ng/尾构建模型。

B、培养时间的确定

(1)取5对斑马鱼亲本交配，按照Westerfield的方法孵化胚胎，将受精后4天的斑马鱼置于解剖显微镜下观察，挑取发育正常的斑马鱼移入6孔微孔板中，每孔放30尾斑马鱼，每孔容量为3mL；

(2)将斑马鱼分为正常对照组和模型组，模型组的斑马鱼通过静脉注射酒石酸长春瑞滨注射液，注射量为2ng/尾，正常对照组不作处理；

(3)正常对照组和模型组在斑马鱼培养液中28℃恒温培养6-72h，取出斑马鱼，利用行为分析仪(Zebra Lab 3.22.3.31，Viewpoint，法国)测定斑马鱼的总运动距离，结果如表2所示。

表2.不同培养时间下斑马鱼的总运动距离

与正常对照组比较，***p<0.001。

由表2数据可知，在注射酒石酸长春瑞滨注射液后培养6-72h后，模型组的斑马鱼均出现了明显的疲劳症状，这表明模型构建成功，为了减少时间成本，选择培养6-24h构建模型最佳。

实施例2

一种百令胶囊的抗癌因性疲乏症效果的评价方法，包括如下步骤：

(1)取5对斑马鱼亲本交配，按照Westerfield的方法孵化胚胎，将受精后4天的斑马鱼置于解剖显微镜下观察，挑取发育正常的斑马鱼移入6孔微孔板中，每孔放30尾斑马鱼，每孔容量为3mL；

(2)将斑马鱼分为正常对照组、模型对照组和百令胶囊组，模型对照组和百令胶囊组的斑马鱼均通过静脉注射酒石酸长春瑞滨注射液，注射量为2ng/尾，正常对照组不作处理；

(3)正常对照组、模型对照组和百令胶囊组在斑马鱼培养液中28℃恒温培养6h，向百令胶囊组的斑马鱼培养液中加入50-150μg/mL百令胶囊，其余两组不变，再28℃恒温培养20h；(4)使用行为分析仪(Zebra Lab 3.22.3.31，Viewpoint，法国)测定斑马鱼的总运动距离(S)。抗癌因性疲乏症功效计算公式如下：

(5)按照ATP含量测定试剂盒(Promega，USA)说明，使用多功能酶标仪进行ATP含量检测(L)。抗癌因性疲乏症功效计算公式如下：

表3.百令胶囊的抗癌因性疲乏症效果评价

与正常对照组比较，***p<0.001，与模型对照组比较，

百令胶囊是一种中药补益剂，具有补肺肾，益精气的功效，据文献记载，其可用于肺癌化疗相关性疲乏感的治疗(周芳,杨柳.百令胶囊对肺癌化疗相关性疲乏感的疗效观察[J].中国社区医师：医学专业,2011(19):1.)。由表3数据可知，百令胶囊组的斑马鱼的总运动距离显著增加，并且体内ATP含量也显著上升。

实施例3

一种中华跌打丸的抗癌因性疲乏症效果的评价方法，其步骤同实施例2，区别在于百令胶囊组被替换为中华跌打丸组，其检测结果如表4所示。

表4.中华跌打丸的抗癌因性疲乏症效果评价

与正常对照组比较，***p<0.001，与模型对照组比较，

由表4数据可知中华跌打丸组的斑马鱼与模型对照组斑马鱼的总运动距离及ATP含量没有显著差别，因此中华跌打丸没有抗癌因性疲乏症的效果。综合百令胶囊的抗癌因性疲乏症效果的评价可表明本发明模型可以有效评价药物的抗癌因性疲乏症效果。