T细胞仿生纳米颗粒A-AuNPs@M及其在光热-免疫联合治疗肿瘤中的应用

摘要

本发明提供的T细胞仿生纳米颗粒A‑AuNPs@M及其在光热‑免疫联合治疗肿瘤中的应用，通过在A‑AuNPs的表面包被T细胞膜制备得到，并提供了其在肿瘤治疗中的应用，属于纳米材料技术领域。本发明提供的仿生纳米颗粒既具有优异的近红外二区光热转换性能，PTT产生的局部高热诱导ICD向肿瘤部位招募CTL，又可以利用T细胞膜表面蛋白激活FasL蛋白依赖的肿瘤细胞凋亡途径，其表面PD‑1蛋白赋予了仿生纳米颗粒免疫检查点抑制剂的功能，具有增强激活适应性免疫应答的能力。这种仿生纳米颗粒介导的光热‑免疫联合治疗不仅消除原发肿瘤，还产生记忆T细胞，有效预防肿瘤复发和转移，为临床有效治疗癌症提供了可能。

说明书

技术领域

本发明属于纳米材料技术领域，尤其涉及到一种T细胞仿生纳米颗粒A-AuNPs@M及其在光热-免疫联合治疗肿瘤中的应用。

背景技术

肿瘤细胞通过逃避免疫监视或阻止免疫反应激活的免疫逃逸机制促进肿瘤的发生。毋庸置疑，全面激活人体免疫系统对于抵抗癌症复发和转移至关重要。然而，在肿瘤浸润淋巴细胞衰竭、免疫抑制因素多样复杂的免疫抑制环境中，单一模式的免疫治疗通常会产生低应答效率和严重的细胞因子释放综合征(CRS)。为了对癌症产生持久的适应性免疫反应，人们设计了基于免疫治疗结合化疗、光热治疗、光动力治疗或放射治疗的多模式治疗方法。

为了实现联合治疗，人们利用纳米材料作为组装平台，将多种元素整合在一起，以增强抗肿瘤效果。据报道，由纳米材料介导的抗癌光热治疗(PTT)会降低肿瘤组织的致密结构，增加血液灌注量，且有助于蓄积治疗药物，促进肿瘤部位内源性免疫细胞的募集，从而形成正反馈，使“冷”肿瘤向“热”肿瘤转化。此外，由光热诱导的肿瘤免疫原性细胞死亡(ICD)可以募集CD8+CTL，激活免疫系统，但由于TME的免疫抑制作用，免疫反应有限，缺乏持久免疫，因此如何快速消除原发肿瘤，增加肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的募集，并产生记忆T细胞抑制远处未治疗的肿瘤，有效预防肿瘤复发，是目前研究的热点。

发明内容

本发明提供了一种T细胞仿生纳米颗粒A-AuNPs@M及其在光热-免疫联合治疗肿瘤中的应用，该纳米颗粒既具有优异的光热转换性能，又具有激活适应性免疫应答的能力，这种仿生纳米颗粒介导的光热-免疫联合治疗不仅消除原发肿瘤，还增加了肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的募集，并产生记忆T细胞抑制远处未治疗的肿瘤，有效预防肿瘤复发，为临床有效治疗癌症提供了可能。

为了达到上述目的，本发明提供了一种T细胞仿生纳米颗粒A-AuNPs@M，通过在聚集态金纳米颗粒A-AuNPs的表面包被T细胞膜制备得到。

作为优选，所述A-AuNPs@M纳米颗粒的平均流体力学直径约为202.4nm，PDI＝0.159。

作为优选，所述A-AuNPs@M通过以下方法制备得到：

向A-AuNPs纳米颗粒中加入20-1000μL 20mg·mL

于5000-12000rpm条件下离心5-20min，收集产物；

将制备得到的T细胞膜与A-AuNPs纳米颗粒进行充分混合，以10kHz-40kHz频率，冰浴超声20-60min；

于0-4℃、12000-16000g条件下，离心15-50分钟，去除未包覆的T细胞膜，得到T细胞仿生纳米颗粒A-AuNPs@M。

作为优选，所加入的A-AuNPs纳米颗粒与T细胞膜蛋白的重量比为1:1.5-1:3。

本发明还提供了一种T细胞仿生纳米颗粒A-AuNPs@M作为光热转换材料在制备用于治疗癌症药物中的应用。

本发明还提供了一种T细胞仿生纳米颗粒A-AuNPs@M基于光热-免疫联合疗法在提高癌细胞杀伤力或延长存活率中的应用。

作为优选，T细胞仿生纳米颗粒A-AuNPs@M在浓度为0-200μg/mL时，采用NIR-II激光、以1.0W/cm

本发明还提供了一种可产生免疫记忆的抗癌材料，采用上述任一项技术方案所述的T细胞仿生纳米颗粒A-AuNPs@M制备得到，做以其为主要有效成分制备得到。

本发明还提供了一种PD-L1阻断剂，采用上述任一项技术方案所述的T细胞仿生纳米颗粒A-AuNPs@M制备得到，做以其为主要有效成分制备得到。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明提供的T细胞仿生纳米颗粒A-AuNPs@M既具有优异的光热转换性能，又具有激活适应性免疫应答的能力。具体的，在光热治疗的辅助作用下，可实现快速彻底消融皮下实体瘤；在免疫治疗作用下，可激活小鼠适应性免疫应答，产生效应记忆T细胞，防止肿瘤复发和转移。与T细胞相比，仿生纳米颗粒体积更小，更容易通过T细胞膜上的PD-1与肿瘤细胞表面PD-L1结合，有效减少肿瘤细胞通过免疫检查点抑制CTL免疫活性，防止CTL衰竭，增强CTL对肿瘤细胞的免疫应答。此外，与T细胞相似，仿生纳米颗粒通过T细胞膜上的蛋白靶向肿瘤，增强肿瘤部位的积累，诱导FasL依赖的癌细胞凋亡。研究结果表明仿生纳米颗粒介导的光热-免疫联合治疗不仅消除原发肿瘤，还增加了肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的募集，并产生记忆T细胞抑制远处未治疗的肿瘤，可以激发强大的抗肿瘤免疫和长期免疫记忆，有效预防肿瘤复发，为临床有效治疗癌症提供了可能。

附图说明

图1为本发明实施例提供的T细胞膜仿生纳米颗粒A-AuNPs@M的制备过程和在肿瘤NIR-II光热-免疫联合治疗的示意图；

图2为本发明实施例提供的A-AuNPs的表征分析，(a)制备的超小尺寸AuNCs的TEM图片，比例尺：2nm；(b)制备的A-AuNPs纳米颗粒的TEM图片(c)制备的A-AuNPs纳米颗粒的TEM图片；

图3为本发明实施例提供的A-AuNPs@M的表征分析，(a)A-AuNPs@M纳米颗粒的TEM图片；(b)A-AuNPs纳米颗粒的和A-AuNPs@M纳米颗粒的动态光散射；

图4为本发明实施例提供的A-AuNPs@M的光热性能分析，(a)不同浓度A-AuNPs@M纳米颗粒的紫外-可见-近红外吸收光谱；(b)200μg/mL的A-AuNPs@M纳米颗粒在不同激光功率密度下的相应温度曲线；(c)A-AuNPs@M纳米颗粒在不同浓度下，激光功率密度为1.0W/cm

图5为本发明实施例提供的A-AuNPs@M的光热性能分析，(a)在不同功率(0.5、0.8和1.0W/cm

图6为本发明实施例提供的A-AuNPs@M的光热性能分析，(a)用功率密度为1.0W/cm

图7为本发明实施例提供的靶向肿瘤细胞能力结果分析，(a)考马斯蓝染色的SDS-PAGE蛋白质分析T细胞裂解物、T细胞膜和A-AuNPs@M；(b)流式细胞术分析T细胞、经胰酶处理的A-AuNPs@M和A-AuNPs@M上FasL和PD-1的表达；

图8为本发明实施例提供的使用DiD-标记的纳米颗粒处理的4T1肿瘤细胞，如tr-A-AuNPs@M、Pb-A-AuNPs@M、A-AuNPs@M的代表性共聚焦荧光显微镜图像，这表明AuNPs@M与肿瘤细胞之间通过PD-1/PD-L1结合而相互作用；细胞核用DAPI(蓝色)标记，比例尺：25μm；

图9为本发明实施例提供的用PBS、tr-A-AuNPs@M、Fb-A-AuNPs@M或A-AuNPs@M处理4T1细胞后的caspase-8表达的蛋白质印迹分析；

图10为本发明实施例提供的经不同浓度A-AuNPs@M纳米颗粒处理LO

图11为本发明实施例提供的细胞水平上的联合治疗结果分析，(a)经不同纳米颗粒处理4T1细胞的相对存活率。其中1代表PBS、2代表tr-A-AuNPs、3代表Fb-A-AuNPs、4代表A-AuNPs@M、5代表A-AuNPs+laser、6代表A-AuNPs@M+laser；(b)流式细胞术分析4T1细胞的凋亡情况；(c)用Calcein(绿色)/PI(红色)染色，PBS、tr-A-AuNPs、Fb-A-AuNPs或A-AuNPs@M处理在有或无红外光照射下，具有代表性的4T1肿瘤细胞的CLSM图像；比例尺：100μm；

图12为本发明实施例提供的在小鼠水平的生物分布，(a)通过尾静脉注射tr-A-AuNPs、Fb-A-AuNPs或A-AuNPs@M纳米颗粒的4T1荷瘤小鼠在第0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h的体内红外荧光成像；(b)通过尾静脉注射tr-A-AuNPs、Fb-A-AuNPs或A-AuNPs@M纳米颗粒的4T1荷瘤小鼠24小时后的心、肝、脾、肺、肾和瘤的图像；(c)通过尾静脉注射A-AuNPs@M纳米颗粒的4T1荷瘤小鼠体内代谢的近红外荧光成像；

图13为本发明实施例提供的在小鼠水平的体内光热效率，(a)不同组荷瘤小鼠的红外照片；(b)激光照射肿瘤部位5分钟内温度的变化；

图14为本发明实施例提供的小鼠模型联合治疗结果分析，(a)治疗第0天和治疗14天后小鼠的数码照片；(b)治疗14天后小鼠肿瘤的数码照片；(c)肿瘤重量(瘤重)；(d)不同治疗下小鼠的肿瘤生长曲线；(e)治疗期间小鼠的平均体重变化；(f)4T1荷瘤小鼠经不同治疗后的存活曲线(n＝5；。

图15为本发明实施例提供的治疗14天后，对4T1荷瘤小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)进行H&E染色；比例尺：100μm；

图16为本发明实施例提供的联合治疗后肿瘤复发和转移结果分析，(a)治疗结束后所有组小鼠的肿瘤生长曲线；(b)治疗结束后PBS组小鼠的肿瘤生长曲线；(c)治疗结束后tr-A-AuNPs@M组小鼠的肿瘤生长曲线；(d)治疗结束后A-AuNPs@M组小鼠的肿瘤生长曲线；

图17为本发明实施例提供的联合治疗后肿瘤复发和转移结果分析(a)A-AuNPs+laser和A-AuNPs@M+laser组小鼠的肿瘤生长曲线；(b)A-AuNPs+laser组小鼠的肿瘤生长曲线；(c)A-AuNPs@M+laser组小鼠的肿瘤生长曲线；

图18为本发明实施例提供的联合治疗后产生记忆T细胞的结果分析，(a)流式细胞术分析效应记忆T细胞的杀伤能力；(b)CCK-8分析效应记忆T细胞的杀伤能力(1代表从正常小鼠种提取的CTL，2代表从PBS荷瘤小鼠脾脏中提取的CTL，3代表从A-AuNPs@M+laser组小鼠脾脏中提取的CTL)；(c)流式细胞术分析效应记忆T细胞。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1A-AuNPs@M的制备

1.1培养EL4细胞并提取细胞膜

EL4细胞系稳定地表达类似于T细胞的多种质膜蛋白，因此本研究使用EL4细胞系来源的T细胞膜。

在含有10％牛血清(FBS)和1％抗生素(PS，青霉素-链霉素)的基础DMEM培养基中对EL4细胞传代培养，离心洗涤并收集细胞沉淀，按照碧云天的膜蛋白提取试剂盒说明书，用冻融法反复破碎上述溶液中的细胞，然后在4℃、700g条件下离心10min。最后将上清液在4℃，15000g条件下离心30min，以沉淀细胞膜碎片。最后将收集的膜碎片保存在-80℃下进行后续实验。

1.2A-AuNPs的制备

根据之前的报道，在室温下，将5mL、20mM的HAuCl

1.3A-AuNPs@M的制备

A-AuNPs纳米颗粒中加入适量的PAH(20mg·mL

实施例2A-AuNPs@M的表征分析

利用谷胱甘肽和HAuCl

为增加肿瘤的靶向性和生物相容性，将A-AuNPs包裹上EL4细胞的细胞膜得到T细胞膜包裹金仿生纳米材料，降低血液清除(ABC)现象，并增加了该纳米载体在体内随血液循环时间，靶向输送至肿瘤组织并主动富集与滞留。为确保T细胞膜成功包裹上A-AuNPs纳米颗粒，我们分别用TEM成像和动态光散射(DLS)进行验证。TEM图像清楚显示(图3a所示)，包覆在纳米核上的是一层清晰而薄的膜；此外，用Zetasizer Nano ZS90测量的A-AuNPs纳米颗粒的平均流体力学直径约为185.5nm(PDI＝0.111)，而测量的A-AuNPs@M纳米颗粒的平均流体力学直径约为202.4nm(PDI＝0.159)(图3b所示)，当包覆上细胞膜时，A-AuNPs@M纳米颗粒的平均流体力学直径较未包裹T细胞膜的A-AuNPs纳米颗粒增大一些，说明细胞膜能够成功包裹上纳米颗粒。

实施例3A-AuNPs@M的光热性能分析

不同浓度A-AuNPs@M纳米颗粒在NIR-II区(1000-1350nm)具有广泛的吸收(图4a所示)，因此在NIR-II激光照射下显示出巨大的光热转换潜力。为探究适合的激光功率密度，分别用激光功率密度为0.5W/cm

实施例4A-AuNPs@M的组织穿透性

由于肿瘤具有一定的浸润深度和厚度，为了探索A-AuNPs@M是否能在理想的组织深度诱导高温，将A-AuNPs@M纳米颗粒水溶液分别覆盖上厚度为2、5和10mm的鸡胸肉，分别用0.5W/cm

根据图6a-6c，计算了A-AuNPs@M纳米颗粒在NIR-II激光照射下的光热转换效率为51.1％。此外，在连续四次用功率密度为1.0W/cm

实施例5A-AuNPs@M的靶向肿瘤细胞能力

5.1A-AuNPs@M膜蛋白的表征

用十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳研究了膜蛋白谱，将制备的T细胞裂解液、提取的T细胞膜蛋白和A-AuNPs@M蛋白用BCA蛋白法测定所检测物质的蛋白浓度。将裂解液与NuPAGE·LDS样品缓冲液混合，然后在10％(w/v)的SDS聚丙烯酰胺凝胶上加入15μg蛋白。电泳后，获得的凝胶立即用考马斯蓝染色，然后洗涤以观察蛋白带。

通过考马斯蓝染色和流式细胞仪分析验证膜蛋白是否被保存在A-AuNPs@M纳米颗粒上。因此对T细胞裂解物、T细胞膜和A-AuNPs@M纳米颗粒进行考马斯蓝染色并对SDS-PAGE蛋白质分析，由图7a所示，T细胞膜上的蛋白质在A-AuNPs@M上高度保存。

为进一步验证A-AuNPs@M纳米颗粒表面FasL和PD-1蛋白被高度保存，用荧光素结合抗FasL和PD-1的抗体进行流式细胞分析，将200μg的A-AuNPs@M在室温条件下吸附于500μL的微球上15min。将A-AuNPs@M珠分别用荧光素结合的APC anti-mouse CD279(PD-1)或PEanti-mouse CD178.1(FasL)进行染色。然后，将混合物洗两次。洗涤后，用流式细胞仪分析染色后的混合物。

作为结果，流式细胞仪分析显示A-AuNPs@M纳米颗粒上FasL和PD-1的蛋白含量很高，而经胰酶处理的T细胞膜包裹纳米粒(tr-A-AuNPs@M)上两者的含量很少(图7b所示)。总之，含有T细胞膜蛋白的A-AuNPs@M具有作为T细胞仿生纳米颗粒的潜力。

5.2A-AuNPs@M靶向肿瘤细胞能力

程序性死亡配体-1(PD-L1)高表达于肿瘤细胞表面，其能与免疫T细胞表面表达的程序性死亡受体(PD-1)相互作用，于是我们研究了AuNPs@M纳米颗粒与肿瘤细胞之间是否可以通过PD-1/PD-L1结合发生相互作用。

具体的，用anti-PD-1抗体阻断A-AuNPs@M上的PD-1，得到antiPD-1Ab处理的A-AuNPs@M(Pb-A-AuNPs@M)。用胰酶处理A-AuNPs@M，得到tr-A-AuNPs@M。将约2×10

如图8的共聚焦图像数据显示，与单独用其他纳米颗粒(tr-A-AuNPs@M和Pd-1阻断的Pd-A-AuNPs@M处理的组相比，A-AuNPs@M处理组明显地观察到DID标记的纳米粒有明显的红色荧光，这表明A-AuNPs@M与癌细胞之间的结合。在用胰酶消化膜上蛋白质的纳米颗粒组中，几乎没有显示纳米颗粒通过蛋白质之间的相互作用与癌细胞结合的荧光。当用抗PD-1抗体阻断膜上PD-1蛋白时，得到的Pd-A-AuNPs@M几乎不能与癌细胞结合，这表明A-AuNPs@M与癌细胞的相互作用主要通过PD-1/PD-L1结合进行。综上所述，这些结果表明，包被T细胞膜的A-AuNPs@M通过与蛋白质的黏附而具有靶向肿瘤的能力，同时A-AuNPs@M可以作为抗癌免疫材料和PD-L1阻断剂。

5.3A-AuNPs@M的FasL-Fas机制

将4T1细胞以每孔约1×10

由图9实验结果可知，与其他治疗组相比，A-AuNPs@M组增加了Fas/FasL信号通路关键下游成分caspase-8的激活，显著抑制癌细胞增殖。

实施例6A-AuNPs@M的细胞毒性

采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测了不同浓度的A-AuNPs@M溶液对正常细胞LO

如图10所示，即使用于处理LO

实施例7A-AuNPs@M在细胞水平上的联合治疗

接下来进行了CCK-8和流式细胞仪分析，以了解A-AuNPs@M纳米颗粒在光热免疫治疗中对4T1细胞的协同抗癌作用。如图11a所示，未经NIR-II激光照射的4T1细胞经A-AuNPs@M处理后的细胞存活率明显低于未经处理或经其他纳米粒子(包括tr-A-AuNPs@M和Fb-A-AuNPs@M)处理的对照组，这表明纳米粒子的T细胞膜上滞留的FasL蛋白通过Westernblotting实验证实是通过Fas/FasL信号通路诱导癌细胞凋亡的。当A-AuNPs或A-AuNPs@M孵育的4T1细胞在1064nm激光照射下，细胞存活率分别急剧下降至30％和约22％，表明光热效应显著促进了细胞的杀伤能力。与激光照射的A-AuNPs相比，A-AuNPs@M的细胞杀伤能力更强，这是由于涂层T细胞膜的免疫作用所致，表明光热和免疫治疗相结合的策略可以提高细胞杀伤能力。细胞凋亡率以光热免疫疗法组最高(62.12％+0.74％＝62.86％)，明显高于单纯光热疗法组(41.44％±1.05％＝45.49％)和单纯免疫疗法组(24.15％±0.90％＝25.05％)(图11b)。因此，流式细胞仪检测的结果与细胞存活率一致，说明联合治疗的效果优于单一治疗。用钙黄绿素-乙酰氧甲酯(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)染色显示活细胞和死亡细胞后，利用共聚焦荧光成像进一步验证不同条件处理细胞的杀伤能力。如图所示，联合用药组红色荧光最强(图11c)，表明几乎所有细胞仍处于晚期凋亡阶段，这也证实了CCK-8和流式细胞仪实验得出的结论。

实施例8A-AuNPs@M在小鼠水平的生物分布和体内光热效率

受到A-AuNPs@M纳米颗粒在体外的细胞杀伤能力的鼓舞，我们研究了体内的治疗效率。首先通过尾静脉将DiD标记的各种纳米粒子(DiD-tr-A-AuNPs@M、DiD-Pb-A-AuNPs@M、DiD-A-AuNPs@M)分别尾静脉注射到携带皮下4T1肿瘤的Balb/c小鼠体内，研究了A-AuNPs@M纳米颗粒的生物分布。我们采用体内成像系统(IVIS)通过跟踪DiD的荧光来研究标记纳米粒子的分布。在我们的设计中，由于包裹纳米颗粒所用的T细胞膜来自于EL4细胞系，是因为EL4细胞系表达多种质膜蛋白，纳米颗粒上的T细胞膜可以避免单核-吞噬细胞系统介导的纳米颗粒清除，从而提高纳米颗粒的循环时间和肿瘤靶向性。特别时纳米颗粒包被膜上的PD-1蛋白发挥双重作用，包括通过粘附与癌细胞结合并阻断PD-L1免疫抑制检查点。同样，FasL蛋白也增强纳米粒子与癌细胞的结合。正如我们所料，在注射后48小时内，用DiD-A-AuNPs@M处理的小鼠肿瘤中的荧光最早出现并且保持最强，表明与DiD-Pb-A-AuNPs@M和DiD-tr-A-AuNPs@M相比，大多数DiD-A-AuNPs@M在肿瘤部位积累，这与CLSM在探索纳米粒子与癌细胞相互作用的实验中的观察结果非常一致(图12a)。在注射后48小时，取出主要器官和肿瘤组织进行离体成像(图12b)，很容易发现，在分别注射了DiD-Pb-A-AuNPs@M和DiD-tr-A-AuNPs@M的两组小鼠中，大多数纳米颗粒积聚在包括肝脏和脾脏在内的网状内皮系统中，而在用DiD-A-AuNPs@M处理的小鼠组中，大多数纳米颗粒积聚在肿瘤中。此外，我们还研究了通过体内成像去除注射纳米粒子的能力。如图12c所示，DiD标记的A-AuNPs@M在肿瘤部位的荧光信号在次日达到最大值，5天后逐渐下降至正常水平，表明设计的纳米颗粒可以被排出体外。上述结果表明我们的纳米颗粒的副作用在给药剂量下可以忽略不计。因此，使用T细胞膜修饰纳米粒子可以显着增强纳米粒子的肿瘤靶向能力，并为该纳米平台的协同治疗提供重要的先决条件。

当纳米颗粒在注射后积累24小时时，我们使用1064nm激光(1W/cm2)局部照射肿瘤部位5分钟，并使用红外热像仪同时记录温度变化。与PBS组温度升高3℃左右相比，接受AuNPs@M和A-AuNPs加上NIRII激光照射的小鼠肿瘤部位的温度分别增加了15℃和22℃(图13a、13b)，表明设计的纳米粒子具有优异的光热产生能力。与单一光热治疗组(用A-AuNPs处理的小鼠)相比，联合治疗组(用AuNPs@M处理的小鼠)肿瘤部位的温度升高更高，表明AuNPs@M促进了体内药物向肿瘤的递送并实现了更多的积累和更长的保留时间。这些纳米粒子在NIRII激光照射下可以产生高温以满足肿瘤热消融的要求，且AuNPs@M有良好的生物安全性。

由于肿瘤的持续积累和良好的NIR-II光热效应，我们推测该A-AuNPs@M纳米颗粒可能会产生显著的协同NIR-II光热免疫治疗效果，并进一步在体内评价其抗肿瘤作用。通过侧面皮下注射4T1细胞完成了BALB/c雌性小鼠原位肿瘤模型的建立。在肿瘤形成后，我们用随机将荷瘤小鼠分为5组(每组5只)，分别是PBS组、tr-A-AuNPs@M组、A-AuNPs@M组、A-AuNPs+laser组和A-AuNPs@M+laser组。荷瘤小鼠首先通过尾静脉注射PBS、tr-A-AuNPs@M、A-AuNPs和A-AuNPs@M，小鼠每2天注射1次。其中，A-AuNPs+laser组和A-AuNPs@M+laser组是在注射24小时后使用功率密度为1.0W/cm2的NIRII激光照射肿瘤部位5分钟。

每隔2天测量一次接受不同治疗的小鼠的肿瘤体积，并记录治疗开始和结束时小鼠的照片(图14a)。治疗后，收集小鼠肿瘤，拍照并称重(图14b，c)。如图14d所示，A-AuNPs+laser组或AuNPs@M+laser组小鼠完全消除了肿瘤，表现出最好的肿瘤生长抑制，表明单独PTT和联合治疗可以有效地消除肿瘤。AuNPs@M组小鼠的肿瘤生长抑制也好于PBS组和tr-AuNPs@M组小鼠。但在治疗过程中，经tr-AuNPs@M处理的小鼠肿瘤单调增大，与空白对照组相似。单一免疫治疗组小鼠在不接受激光照射的情况下接受AuNPs@M治疗，40％的小鼠有效地抑制了肿瘤的生长，甚至消除了肿瘤，60％的小鼠表现为肿瘤逐渐生长，生长速度较慢。接受单一PTT(A-AuNPs+laser组)的小鼠与接受联合治疗(AuNPs@M+laser组)的小鼠显示出显著差异，单纯PTT组小鼠肿瘤体积均呈先增大后减小的趋势。联合治疗组小鼠肿瘤体积单调缩小，肿瘤提前消除。因此，在综合比较中，协同光热-免疫疗法显示出最好的抗肿瘤效果。我们还分析了AuNPs@M在体内的生物相容性和生物安全性。在治疗过程中，所有小鼠的体重没有显着变化(图14e)。不仅如此，光热-免疫联合疗法显著延长了他们的存活率(图14f)。

此外，如图15所示各组主要器官(心、肝、脾、肺、肾)切片的H&E染色显示无明显炎症和细胞死亡信号，表明纳米颗粒无毒性。

实施例9联合治疗后肿瘤复发和转移分析

为了验证纳米颗粒是否能有效的抑制肿瘤复发，在治疗结束后，将携带有肿瘤的小鼠进行手术切除，约15天左右，观察接受不同治疗后小鼠是否有复发情况，在观察期间，测量肿瘤相对体积大小。由实验结果可知，PBS组和tr-A-AuNPs@M组的难以防止肿瘤的复发，小鼠肿瘤出现100％复发情况(图16b，c)。而单免疫组(A-AuNPs@M)虽然可以通过诱导宿主免疫以抑制肿瘤的复发或转移，但由于肿瘤自身较弱的免疫原性以及呈现免疫抑制性的肿瘤微环境，免疫疗法的个体差异性明显，一开始并不能根除肿瘤，因此出现50％的复发情况(图16d)。单光热组(A-AuNPs+laser)可以通过热消融的方式高效杀伤原位肿瘤，并且死亡的肿瘤细胞可通过PTT诱导的免疫原性细胞死亡(ICD)，能够有效的抑制肿瘤的复发。而光热-免疫组(A-AuNPs@M+laser)通过PTT产生的热快速消融原位肿瘤的同时激活宿主免疫，获得了最高的抗肿瘤效果和较强的免疫效果(图16a)，所有小鼠均未检测到肿瘤。

为了验证治疗组是否能有效的抑制肿瘤转移，观察15天后，将肿瘤未复发的小鼠即单光热组和光热-免疫组，用同源4T1细胞悬液(每只小鼠约1×10

实施例10联合治疗后产生记忆T细胞的分析

形成记忆的能力是适应性免疫系统预防再次感染的关键，记忆T细胞会在下一次抗原入侵时再次将记忆中的杀毒方法再次调动出来，再次破坏靶细胞，释放出靶细胞中的抗原。为了更好地了解复发和远端转移，我们进一步将接受联合治疗后第45天的小鼠接种上4T1细胞形成远处肿瘤，然后提取脾细胞(一种T淋巴细胞)。取荷瘤小鼠(经PBS处理)的脾细胞作为同型对照，而对照组的脾细胞取自健康小鼠，所有提取的细胞都被消化成单细胞悬液。将不同组小鼠的脾细胞分别与处于指数生长期的4T1癌细胞混合，共孵育36小时，通过CCK-8实验评估癌细胞的细胞活力，如图18b所示，在与联合治疗小鼠的提取T细胞孵育后，癌细胞的活力明显低于与同种型细胞共孵育的癌细胞。如图18a所示，利用流式细胞术分析的凋亡癌细胞百分比与CCK-8检测检测到的死亡癌细胞比例一致，这意味着联合治疗产生了CD8+CTL并增强了杀伤癌细胞的能力。

众所周知，免疫记忆可以有效地阻止肿瘤的的生长并产生长期免疫反应。为了研究生物体是否引发免疫记忆，在肿瘤转移模型中自我消除肿瘤后第30天的小鼠被用于使用流式细胞术分析脾脏中的中央记忆T(TCM)细胞和效应记忆T(TEM)细胞。众所周知，TCM细胞可以在抗原刺激开始时迅速扩增，而TEM细胞(CD3+、CD8+、CD62L、-CD44+)可以通过产生IFN-γ、IL-4细胞因子和穿孔素来提供强大的保护性免疫记忆反应。值得注意的是，观察到接受联合治疗的小鼠的TEM细胞百分比远高于接受手术的小鼠(图18c)，证实了光热免疫疗法的协同策略诱导了强大的免疫记忆，即光热-免疫联合治疗能够产生显著的协同治疗效果，全流程示意图如图1所示。