调控番茄果实可溶性固形物含量的基因组结构变异及相关产品和应用

摘要

本发明涉及植物分子育种技术领域，特别涉及调控番茄果实可溶性固形物含量的基因组结构变异及相关产品和应用。该基因组结构变异为如下序列中的至少一种：SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；上述序列的互补序列、简并序列或同源序列；在严紧条件下与上述序列杂交的核苷酸序列或其互补序列；gDNA序列。上述基因组结构变异丰富和完善了现有控制番茄果实SSC相关的关键遗传变异信息，为SSC遗传分子调控机制等基础理论研究提供了新的证据或方向，同时为SSC等番茄果实品质、产量育种改良等应用研究提供了新的支撑。

说明书

本申请要求于2022年04月27日提交中国专利局、申请号为202210453401.7、发明名称为“调控番茄果实可溶性固形物含量的基因组结构变异及相关产品和应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及植物分子育种技术领域，特别涉及调控番茄果实可溶性固形物含量的基因组结构变异及相关产品和应用。

背景技术

番茄作为世界第一大蔬菜作物，具有重要经济和营养价值。番茄果实品质作为其核心和关键的商品性状，对产业发展影响越来越大。可溶性固形物(Soluble solidscontent，SSC)是衡量番茄果实品质和产量的重要指标，主要由可溶性糖和有机酸等营养物质组成，SSC的高低直接影响番茄的风味品质和产量(尤其是加工番茄)，同时SSC对番茄抗逆具有重要作用。目前，番茄中通过经典遗传学手段或者全基因组重测序关联分析已经报道或克隆了SSC相关两个主效QTL，分别位于番茄9号和11号染色体上，其中9号染色体上主效基因Lin5已经被克隆并广泛应用。但是仅基于这两个主效QTL在番茄SSC改良方面远远不够，尤其是目前番茄栽培品种遗传背景越来越狭窄，传统常规育种手段以及种质资源很难在番茄SSC改良上取得很大突破。因此，迫切需要挖掘新的番茄SSC相关遗传变异并利用，以实现番茄SSC改良的突破，从而大大加速番茄品质和产量遗传改良，促进番茄产业快速健康发展。

发明内容

有鉴于此，本申请提供了新的调控可溶性固形物含量的基因组结构变异及相关产品和应用。本申请通过多组学分析发掘到两个新的控制番茄果实SSC含量的基因组结构变异，首次发现了基因组结构变异对番茄品质和产量的影响，丰富和完善了现有控制番茄果实SSC相关的关键遗传变异信息，为SSC遗传分子调控机制等基础理论研究提供了新的证据或方向，同时为SSC等番茄果实品质、产量育种改良等应用研究提供了新的支撑。

基因组结构变异(Structure Variations,SV)是一类基因组上大长度的序列变化和位置关系变化，包括50bp以上的长片段插入、缺失、重复，染色体倒位、易位及拷贝数变异等。与传统微卫星重复序列(SSR)、插入缺失(InDel)和单核苷酸多态(SNP)等变异类型相比，在人类等研究中发现SV对基因组及表型影响更大(尤其是一些重要致病、缺陷和癌症等疾病)。目前植物中的SV研究还不多，更鲜有SV对番茄品质和产量的基础理论和应用研究报道。因此，本申请发掘到的番茄基因组中SV，以及利用其开发的高效、通用的分子标记，可以对SSC含量进行快速有效的有利等位变异聚合或者筛选，对番茄品质改良等商业化育种应用和遗传学研究具有十分重要的实践和理论意义。

为了实现上述发明目的，本申请提供以下技术方案：

本申请提供了两个与番茄果实SSC显著相关的基因组结构变异SV-1和/或SV-2，其中，所述SV-1为如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

2)所述1)中所示序列的互补序列、简并序列或同源序列，其中所述同源序列为与1)中所示序列具有75％或以上同一性的核苷酸序列；

3)在严紧条件下与1)中所示序列杂交的核苷酸序列或其互补序列；

4)所述序列1)-3)中任一序列的gDNA序列；

所述SV-2为如下序列中的至少一种：

5)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

6)所述5)中所示序列的互补序列、简并序列或同源序列，其中所述同源序列为与5)中所示序列具有75％或以上同一性的核苷酸序列；

7)在严紧条件下与5)中所示序列杂交的核苷酸序列或其互补序列；

8)所述序列5)-7)中任一序列的gDNA序列。

在本申请中，与SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有低于75％同一性的核苷酸序列，但与SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2具有相同关键结构变异特征和目标染色体位置，该序列也在本发明保护范围之内。具体的，所述具有相同关键结构变异特征指，与SV-1相同的缺失特征，和/或与SV-2相同的插入特征。

其中，核苷酸序列分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；核苷酸序列分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化、点突变或基因编辑等方法，对本申请的目标基因组结构变异核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本申请分离得到的核苷酸序列75％或者更高同一性或相同关键基因组结构变异特征和目标染色体位置的核苷酸序列，均是衍生于本申请的核苷酸序列并且等同于本申请的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核苷酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

本申请实施例还提供了一种生物材料，该生物材料为下述1)至3)中的任一种：

1)人为引入或敲除上述SV-1和/或SV-2全部或部分核苷酸序列的重组载体；

2)人为引入或敲除上述SV-1和/或SV-2全部或部分核苷酸序列的重组微生物；

3)人为引入或敲除上述SV-1和/或SV-2全部或部分核苷酸序列的植物细胞系；

在本申请中，植物细胞系可包括繁殖材料，也可不包括繁殖材料。

本申请还提供了上述基因组结构变异和/或生物材料在调控番茄的可溶性固形物(SSC)含量中的应用。

在本申请提供的具体实施例中，该应用通过分子操作上述基因组结构变异实现，分子操作包括基因编辑和/或遗传转化。

利用上述SV位点开展基因编辑、遗传转化等分子操作可实现番茄果实SSC含量的分子育种改良和种质资源创新。

在本申请实施例还提供了一种提高番茄的可溶性固形物含量的方法，该方法通过引入SV-1的缺失和/或SV-2的插入实现。

在本申请提供的具体实施例中，引入所述SV-1的缺失和/或SV-2的插入的方式包括但不限于CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12基因编辑技术。

本申请还提供了一种番茄植物或其植物部分，所述番茄植物为如下植物之一：

1)上述生物材料中的植物细胞系生长形成的植物；

2)上述提高番茄的可溶性固形物含量的方法生产获得的植物；

3)上述1)-2)中任一植物自交所形成的后代，以及后代生长形成的植物；

4)上述1)-2)中任一植物与其它品种杂交所形成的后代，以及后代生长形成的植物。

所述植物部分为根、茎、叶、花、果实、植物细胞、花粉或种子。

本申请还提供了一种分子标记，包含用于鉴定上述基因组结构变异的分子标记。

在本申请提供的具体实施例中，用于鉴定上述基因组结构变异的分子标记为KASP分子标记。但分子标记种类并非限定于此，本领域技术人员认可的分子标记种类均在本发明保护范围之内。

在本申请提供的具体实施例中，用于鉴定SV-1的分子标记为KASP1；

作为优选，KASP1扩增引物对包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示引物。

在本申请提供的具体实施例中，用于鉴定SV-2的分子标记为KASP2；

作为优选，KASP2的扩增引物对包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物。

在本申请中，还可以进一步将本申请两个SV与其他相关SNP、InDel等不同遗传变异位点组合在一起，组成控制番茄果实SSC相关完整分子标记检测Panel，通过该分子标记Panel基因型鉴定分析实现对番茄果实SSC含量更加精准预判和有效筛选。

针对本申请中鉴定获得的番茄果实SSC相关SV位点，除了开发设计相应KASP标记外，还可以通过定制靶向捕获测序探针、基因芯片探针或者设计多重PCR引物等方式实现目标区段基因型精准鉴定检测，具体情况根据不同项目要求及目的实施优化调整或替代。

本申请还提供了一种用于捕获上述基因组结构变异的杂交捕获探针。

本申请还提供了一种用于扩增上述基因组结构变异的引物。

作为优选，用于高效率、低成本跟踪鉴定上述基因组结构变异的手段为前述KASP标记。

本申请还提供了上述基因组结构变异SV、分子标记、杂交捕获探针或引物中的任一种在番茄目标区段基因型鉴定、番茄果实可溶性固形物含量高低预判或基因组选择育种中的应用。

在本申请中，通过重测序、靶向测序、KASP标记等手段检测上述全部或部分SV多态性或基因型在鉴定番茄SSC含量、制备鉴定产品或番茄分子标记辅助育种中的应用。

本申请还提供了一种由上述番茄植物或其植物部分制成的植物产品，所述植物产品包括但不限于食品、化妆品、药品或饲料。

本申请还提供了一种制造商业植物产品的方法，包括获得上述的番茄植物或其植物部分，制造所述商业植物产品。

相比于现有技术，本申请具有的有益效果如下：

本申请通过三代基因组测序技术结合二代测序数据构建番茄泛-图基因组，更加真实和完整地展示并鉴定了SV、InDel和SNP等番茄多种基因组变异信息，并通过多组学分析发掘到两个新的控制番茄果实SSC含量的基因组结构变异SV，丰富和完善了现有控制番茄果实SSC相关的关键遗传变异信息，为SSC遗传分子调控机制等理论研究提供了新的证据或方向，同时为SSC等番茄果实品质、产量育种改良等应用研究提供了新的支撑。

此外，本申请进一步将发掘的两个控制番茄果实SSC含量的基因组结构变异SV转化开发为可以商业化育种应用的分子标记，并通过传统遗传群体和包括更多现代主流商品种及育种中间材料的种质资源群体进行验证分析，解决了前述现有技术方案中缺乏快速、简单和高效的高通量自动化的分子标记鉴定筛选的商业化育种手段，以及相关遗传变异在番茄现代商业育种中应用现状及前景分析等问题。

本申请提供了两个控制番茄果实SSC含量的基因组结构变异的发掘及其应用方案。所述鉴定获得的番茄果实SSC含量相关SV及侧翼序列信息可以为靶向测序、基因芯片、基因克隆及功能研究等其他技术拓展或研究提供有力支撑帮助；所述开发获得的可商业化育种应用KASP标记可实现对番茄果实SSC相关基因组结构变异区段单倍型的快速、精准和高通量检测，具有操作简单、成本低廉、可自动化、通量效率高、标记稳定、安全无毒无害等优点，可以在番茄苗期快速、准确和高通量的进行目标区段基因型精准鉴定，从而预判成株期果实SSC含量高低，减少后期果实品质鉴定和田间移栽工作量，提高育种效率、降低育种成本、加速育种进程，非常适合现代商业化育种应用及大规模遗传改良研究。

附图说明

图1为通过番茄泛-图基因组研究鉴定发掘果实可溶性固形物SSC相关基因组结构变异SV及其分子育种应用潜力分析；其中a是利用LASSO模型对SSC相关SVs及附近基因进行关联检索分析得到3个显著相关新的候选基因，b是对三个SSC相关SVs对临近基因表达水平影响分析，c是利用两个显著相关SV进行SSC全基因组选择预测；

图2为上述两个SSC显著相关SV开发可商业化育种应用的分子标记技术方案；其中a对应SV-1(SV2_44168216)，b对应SV-2(SV4_54067283)；

图3为上述番茄果实SSC显著相关SV位点开发的两组KASP标记在包含348份F2单株、亲本及F1的遗传群体中的分型情况；其中A为KASP1(对应SV-1)，其中B为KASP2(对应SV-2)，横坐标代表FAM荧光信号值(I处红色圆点，代表A替换基因型或Favorable alleles)，纵坐标代表HEX荧光信号值(III处蓝色圆点，代表R参考基因型或Non-Favorable alleles)，中间II处紫色圆点代表杂合基因型，靠近原点IV处灰色原点代表NTC阴性对照或未成功扩增无信号样本；

图4为根据上述两组KASP标记对番茄F2群体(TS-623*TS-002)及亲本两个目标SV位点基因型鉴定结果，随机调查不同基因型组合单株成熟果实可溶性固形物含量(SSC)统计分析结果；横坐标中字母“A”代表替换基因型或Favorable alleles，“R”代表参考基因型或Non-Favorable alleles，字母“H”代表杂合基因型Heterozygous alleles；不同基因型组合前一位字母代表SV-1(SV2_44168216)位点基因型，后一位字母代表SV-2(SV4_54067283)位点基因型，MM代表亲本TS-002，F1代表亲本TS-623与TS-002杂交获得F1；下方“n”代表各基因型组合F2单株或亲本及F1实际成功检测SSC单株数量；直线上方“*”代表两侧箭头所指基因型组合样本之间SSC值差异达到显著水平(P≤0.05)，“**”代表基因型组合样本之间差异达到极显著水平(P≤0.01)。

附图中英文注释：

Chromosome：染色体；

Major alleles：主要等位基因；

Minor alleles：次要等位基因；

Standardized gene expression：标准化基因表达；

Favorable alleles：有利等位基因；

Non-Favorable alleles：不利等位基因；

BLUP of SSC：SSC的最佳线性无偏预测(Best Linear Unbiased Prediction,简称BLUP)；

Both：两者；

deletion：删除；

insertion：插入；

probe：探针；

ref：参考等位基因；

alt：变异等位基因。

具体实施方式

本发明公开了调控可溶性固形物含量的基因及相关产品和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本申请通过大量三代测序结合二代重测序数据构建番茄泛-图基因组，鉴定了SV、InDel和SNP等番茄多种基因组变异信息，并通过多组学手段发掘了两个新的控制番茄果实SSC含量的基因组结构变异SV。而前述现有技术方案大多基于二代重测序数据发掘的SSC相关SNP或小片段InDel变异。

本申请还将上述新发掘的调控番茄果实SSC相关SV转化为可商业化育种应用的KASP标记，并在传统遗传群体和包括更多现代主流商品种及育种中间材料的种质资源群体等不同类型丰富的材料中进行验证分析应用。而前述现有技术方案大多未提供适合高通量、自动化的商业化育种应用的分子标记解决方案，或者目标遗传变异在番茄种质资源及主流商业品种中的基因型类型信息不完善，后续验证材料的来源、类型或数量有限。

本申请的目的是提供两个控制番茄果实可溶性固形物含量的基因组结构变异以及育种应用。

本申请提供了两个控制番茄果实可溶性固形物含量SSC的基因组结构变异SV以及可商业化育种应用的分子标记，所述SV是指通过长片段三代基因组测序鉴定获得的大片段缺失、插入或异位、倒位等传统二代测序无法有效鉴别的基因组结构变异，所述可商业化育种应用的分子标记是指利用上述SV转化开发的适合高通量、自动化检测的准确可靠的PCR标记。本项目团队通过132份不同类型的番茄品种泛-图基因组构建结合基因表达分析发掘了两个控制番茄果实SSC的两个基因组结构变异SV2_44168216(即SV-1)和SV4_54067283(即SV-2)，其序列信息详见序列表。考虑到靶向测序、重测序、PCR扩增及芯片杂交等SV不同检测方法的多样性、成功率和基本原理的通用性，以及已克隆基因功能、分子调控网络机制的不确定性，因此上述两个番茄果实SSC显著相关SV位点及其邻近序列在下述应用也应在本发明的保护范围之内；

通过重测序、靶向测序等手段检测上述全部或部分SV多态性或基因型在鉴定番茄SSC含量、制备鉴定产品或番茄分子标记辅助育种中的应用；

利用上述SV位点序列信息通过开发PCR标记或者基因芯片杂交探针等物质在鉴定番茄SSC含量、制备鉴定产品或番茄分子标记辅助育种中的应用；

利用上述SV位点开展基因编辑、遗传转化等分子操作实现番茄果实SSC含量的分子育种改良和种质资源创新。

本申请还提供一种检测番茄SSC含量的高效PCR分子标记组合，所述高效PCR分子标记组合是指利用上述两个SV位点成功开发能够快速直观有效鉴定区分目标位点基因型状态的KASP标记组合，选用该KASP标记组合即可准确判定被检测番茄材料中控制SSC含量的关键基因组区段的单倍型，进而辅助开展番茄果实SSC含量快速精准鉴定和育种改良应用。所述成功分型的KASP分子标记组合包括2组PCR标记，即KASP1和KASP2分别对应前述基因组结构变异SV-1和SV-2目标位点序列及侧翼序列开发，其引物序列详见实施例和序列表。上述KASP标记组合的序列信息及物质在辅助鉴定番茄果实SSC含量、制备相关鉴定或辅助鉴定产品以及番茄分子育种和种质资源创新的应用，也应在本发明的保护范围之内。

术语解释：

泛-图基因组(Graph pan-genome):泛基因组(Pan-genome)即表示一个物种全部基因全称，有别于个体基因组的基因，包括核心基因(Core gene，即该物种所有样本共有的基因)、非核心基因(Dispensable gene，即该物种中部分样本中存在的基因)和个体特异性基因(Strain-specifific gene，即某一个体特有基因)；图形基因组(Graph genome)是相对线性参考基因组而言，即把一个物种的所有遗传变异信息添加到参考基因组中，包括重复序列变异、单核苷酸多态SNP、小片段插入缺失InDel以及线性基因组无法鉴定发掘染色体结构变异SV和拷贝数变异CNV等变异类型。

染色体结构变异(structural variation,SV)：是染色体变异的一种，是内因和外因共同作用的结果，外因有各种射线、化学药剂、温度的剧变等，内因有生物体内代谢过程的失调、衰老等。主要类型有缺失、重复、倒位、易位；

可溶性固形物(Soluble solids content，SSC)：指可溶性糖类物质或其他可溶物质；

KASP：是竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)的缩写，可在广泛的基因组DNA样品中，对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断；

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径中获得。下述实施例中所用部分已知果实SSC含量的番茄材料，包括TS系列番茄种质资源为国内外公开资源，社会公众可向中国农业科学院农业基因组研究所或者其他科研单位索取以重复本实验，其余番茄商品种可依据附件清单通过正规商业途径获得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：控制番茄果实可溶性固形物含量SSC的基因组结构变异SV发掘

本发明实施例通过132份番茄核心种质资源的HiFi或ONT三代基因组重测序结合706份种质资源二代重测序数据，其中32份材料通过构建HiFi SMRTbell文库和PacBioSequel II平台测序获得20～39Gb高质量、长片段三代测序数据，并结合了46份材料的ONT数据，按照项目组开发的流程完成了基因组组装和注释，最终构建了番茄的泛-图基因组TGG1.1并更新了线性基因组SL5.0版本(Heinz1706)，在此基础上更新了现有番茄变异组信息，包括17.90M SNPs、1.5M InDels和196K SVs。通过332份番茄核心种质资源的转录组、代谢组等多组学WGCNA分析，最终筛选鉴定到103个SSC相关候选基因，对SSC的遗传力贡献了0.33(接近SSC总遗传力的52.9％)。通过LASSO模型统计分析，最终鉴定到其中25个基因涉及SVs变异引起基因差异表达(eQTL)，并且有3个SSC显著相关的SVs物理位置非常接近功能基因区域，如图1a所示。其中SV-1对应SV2_44168216_delection，位于SL5.0 Chr02:44,168,216，替换基因型为4,664bp大片段缺失；SV-2对应SV4_54067283_inserction，位于SL5.0 Chr04:54,067,283，替换基因型为1,900bp大片段插入(两个SV序列信息详见序列表)。并且两个SV都极显著地影响了临近两个糖代谢相关基因的表达(图1b)。进一步通过全基因组选择预测模型分析发现，上述两个结构变异位点为有利等位变异基因型的SSC育种值BLUP显著高于非有利等位变异基因型，并且当这两个结构变异位点均为有利等位变异基因型时的SSC育种值BLUP要显著高于单一位点为有利等位变异基因型的BLUP，表明两者有很强累积叠加效应，如图1c所示。

进一步统计发现，上述番茄核心种质资源的群体的SSC表型值与上述两个目标SV区域单倍型呈现极显著正相关，也即两个SV位点均为替换型Alt(A)(或称为Favorablealleles)的种质资源SSC值整体显著高于单一SV位点为A的种质资源，后者的SSC值又整体显著高于两个SV位点均为参考型Ref(R)(或称为Non-favorable alleles)的种质资源，详见表1。

表1、332份番茄核心种质资源两个SV位点基因型与SSC表型值统计分析

注：1)番茄核心种质资源4种基因型实际有效统计数307份，有25份SSC表型或者目标SV测序基因型鉴定数据缺失；2)R代表参考基因型或Non-favorable alleles，A代表替换基因型或Favorable alleles；3)a、b、c分别代表p≤0.05水平的统计分析显著性差异(依次代表差异从大到小排序)。

上述结果表明，通过番茄泛-图基因组结合转录组、代谢组等多组学手段筛选鉴定获得的基因组结构变异SV-1和SV-2与番茄果实SSC显著相关，当SV-1和SV-2表现为替换基因型时，SSC显著提高，亦即当SV-1对应序列缺失时SSC显著提高，同样的，当SV-2对应序列插入时SSC也显著提高。并且进一步通过全基因组选择模型预测和表型统计分析分析发现，两个位点的替换基因型对番茄果实SSC有明显的累积叠加效益，即同时存在SV-1对应序列的缺失和SV-2对应序列的插入时，SSC相较单一存在SV-1或SV-2呈现极显著提高。也即可以通过对上述两个基因组结构变异位点的人为选择或改造，实现番茄果实SSC不同水平的调控。

实施例2：利用上述两个SVs转化开发可商业化育种应用的分子标记

针对上述两个控制番茄果实SSC的基因组结构变异，需要实现对目标SV位点的快速、有效、高通量和低成本的基因型检测，才能加快上述有利SV在番茄商业化育种改良和种质资源创新研究中广泛应用。相对于重测序、靶向测序、基因芯片、质谱等技术手段而言，PCR分子标记(尤其是低成本、高通量KASP标记)是检测上述少数SV位点的更优选择。利用本申请构建的番茄泛-图基因组参考信息，按照KASP标记设计开发原则(目标产物80～150bp，引物在参考基因组上特异匹配目标区域且位于非SNP密集区域，避免A\T或G\C含量高等复杂序列区域等)，利用Primer3.0软件设计KASP标记(图2)。利用Thermo Fisher公司的Applied Biosystems QuantStudio 3(ABI-Q3)荧光定量PCR仪检测筛选后，最终分别获得了各1组多态性好、分型效果理想的KASP引物用于后续的验证，相应引物序列详见表2。

表2、利用两个番茄果实SSC含量相关SV成功开发的KASP标记引物相关信息

DNA提取采用常规CTAB法或国产磁珠试剂盒从番茄叶片中提取基因组DNA，利用Nanodrop 1000进行核酸浓度测定，稀释并控制DNA模板浓度为10～20ng/μL。

KASP标记PCR扩增反应体系(10μL)包括基因组DNA 5μL(50～100ng)，引物混合工作液0.14μL(优选引物混合配比为特异分型引物各12μL，公共引物30μL，再加46μL ddH

按照荧光定量PCR仪ABI-Q3仪器操作手册，编辑样品及引物排布模板，执行运行程序{30℃读取荧光信号1min；94℃变性15min；94℃变性20s，61℃退火60s，重复此步骤10个循环，每个循环设置Touch-Down降温0.6℃，最终退火温度降到55℃；94℃变性20s，55℃退火60s，重复此步骤28～32个循环；30℃读取荧光信号1min}，分析数据结果，最终各选取1组FAM信号、VIC信号以及杂合荧光信号聚集分型趋势显著的KASP引物组合，开展上述番茄核心种质资源和主流商品种的KASP标记分型。

其中KASP 2×Master Mix(Low Rox)主要包含荧光探针A、荧光探针B、猝灭探针A、淬灭探针B、高保真Taq酶、dNTP、Mg

最终标记分型结果汇总在表3中，结果表明，标记分型结果与前述基于二代或三代重测序生物信息分析两个SV位点基因型结果完全一致，充分验证了上述两个SV位点的真实性以及基于两SV开发的KASP标记检测分型的准确可靠性。也即上述成功开发的两组KASP标记完全可以低成本、高通量和精准地取代重测序方法鉴定上述两个番茄果实相关基因组结构变异SV位点，尤其是在传统二代测序技术无法有效鉴定SV而三代测序技术成本较昂贵情况下。并且成功开发的两组KASP标记对25份未开展基因组重测序分析的主流商品种进行目标SV位点基因型鉴定结果，结果与实施例1一样表现出相同的规律，也即KASP1和KASP2鉴定两个SV位点基因型均为替换型A或杂合基因型H的主流商品种的果实SSC值显著高于仅单一位点为A或H的商品种，后者的SSC值又显著高于两个位点均为参考型R的商品种，详见表3。

表3、94份番茄核心种质资源及商品种两个SV位点重测序及KASP标记分型结果

注：1)SV-1和SV-2两栏为直接根据重测序数据判定两个SV位点基因型，KASP1和KASP2两栏为根据KASP标记分型判定上述两位点基因型，其中R代表参考基因型，A代表替换基因型，H代表杂合基因型，-代表缺失数据；2)Line#栏中a代表该样本重测序数据来源为三代HiFi或ONT，b代表样本重测序数据来源为二代Illumina，c代表样本未开展重测序分析。

上述结果表明，本申请成功开发了两组KASP标记可以完全取代重测序技术，在不同遗传背景中对目标基因组结构变异SV-1和SV-2实现低成本、高通量、精准地重复鉴定。并且对25份未知目标位点基因型的市场主推商品种进行KASP标记分型，结果发现上述两个SV位点基因型仍然与番茄果实SSC呈极显著正相关，再一次验证了实施例1的结论，同时也证明可以在番茄商业化育种中通过上述两组KASP标记的分型检测成功实现对番茄果实SSC的辅助选择。

实施例3：利用F2分离群体进一步验证上述SSC相关分子标记

鉴于上述番茄核心种质资源和主流商品种类型来源广泛、遗传背景复杂，而果实SSC受到多个基因或遗传位点调控(除本申请关注的两个基因组结构变异SV-1和SV-2外)。因此，我们利用果实高SSC值且两个目标SV位点均为A替换基因型的材料TS-623与果实低SSC值且两SV位点均为R参考基因型的材料Moneymaker(TS-002)杂交后自交构建获得遗传背景较单一的F2群体，利用上述成功开发的两组KASP标记对该群体进行遗传分析和育种应用验证。

DNA提取方法、KASP标记扩增方法、条件及要求同实施例2。检测样品包括上述群体中336个F2单株、两个亲本及杂种F1各3个重复，加上3个ddH

根据上述基因分型结果，对该F2群体两个目标SVs位点进行遗传模型卡方测验分析，确认两位点均符合明显的完全独立单基因遗传分离模型(1:2:1分离，χ

表4、基于KASP标记对F2群体(TS-623*TS-002)目标位点进行基因型鉴定和遗传分析

注：1)336株F2群体基因型有效统计数331份，其中有5份SV-1位点基因型数据缺失；2)R代表参考基因型或Non-favorable alleles，A代表替换基因型Favorable alleles，H代表杂合基因型；3)a代表χ

根据上述两个SV位点开发KASP标记基因分型结果，我们随机挑选出AA、AH、AR、HA、HH、HR、RA、RH、RR共9种基因型F2单株各10～30株{其中字母“A”代表替换基因型，字母“R”代表参考基因型，字母“H”代表杂合基因型，不同基因型组合前一位字母代表SV-1(SV2_44168216)位点基因型，后一位字母代表SV-2(SV4_54067283)位点基因型}，以及亲本TS-002和F1单株各5～10株，移栽盆钵后转到露天种植，正常统一定量控制肥水管理，待番茄转色成熟后每株收获3～5个第2节位果实用糖度仪(Atago)测定SSC值，并利用Origin 2019软件中“单因素方差分析”对上述9种基因型F2及亲本和F1单株的SSC值进行差异显著性分析(图4)。

结果如预期，在单一的遗传背景下，相同基因型F2单株SSC表型值与上述两个目标SV区域单倍型呈现极显著正相关，也即两个SV位点均为替换型A的F2单株SSC值整体显著高于单一SV位点为A的单株，后者的SSC值又整体显著高于两个SV位点均为参考型R的单株；多数基因型平均SSC值之间差异均达到显著(P≤0.05)或极显著(P≤0.01)水平；其中AA基因型F2单株平均SSC值为7.46％，AR基因型F2单株平均SSC值为6.63％，RA基因型F2单株平均SSC值为5.81％，RR基因型F2单株平均SSC值为4.80％；HH基因型F2单株平均SSC值为6.34％，极显著高于RR基因型F2单株平均SSC值4.80％，略高于HR基因型F2单株平均SSC值5.53％和RH基因型F2单株平均SSC值5.66％(差异均不显著)；HH基因型的F2单株平均SSC值6.34％虽略低于双亲杂种F1(基因型也为HH)平均SSC值7.19％，但差异不显著。这也与实施例2中不同遗传背景的25份商品杂交种F1两个目标SV位点为H或A均能够显著提升果实SSC的现象相吻合；因此，上述规律与实施例1中基于不同遗传背景种质资源群体基因组选择预测SSC育种值BLUP差异(图1c)以及实施例2中主流商品种目标SV位点基因型与SSC值变异(表3)规律基本一致。

综上所述，本申请通过泛-图基因组结合多组学手段发掘了两个番茄果实SSC相关基因组结构变异SV，丰富了现有番茄果实品质产量相关遗传变异类型和来源位点；并且这两个SV位点的有利等位变异基因型在番茄核心种质资源、主流商品种及双亲遗传群体中均对番茄果实SSC贡献很强的累积叠加效应，可以通过对上述两个基因组结构变异位点的人为选择或改造，实现番茄果实SSC不同水平的调控。两个目标SV位点基因型都可以被重测序或分子标记等手段有效鉴定。本申请优选提供了两组高通量、低成本的KASP标记可以高效准确地在不同遗传背景中实现对两个目标SV位点基因型的高效精准鉴定，从而实现对番茄果实SSC的辅助选择。因此，本申请提供的两个番茄果实SSC相关基因组结构变异以及对应开发的2组高效KASP标记可以直接用于番茄果实品质遗传改良和分子育种商业化应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。