一种区别不同基原桑黄类真菌的方法与应用

摘要

本发明公开了一种区别不同基原桑黄类真菌的方法与应用。本发明所述方法为：将桑黄样品预处理；用UPLC‑Q‑TOF‑MSE进行数据非依赖模式采集数据，将采集的数据分别进行FBMN构建及可视化，得到每个桑黄的分子网络图形；再将所采集的不同基原桑黄的数据同时进行FBMN构建及可视化，得到桑黄样品的分子网络图形；最后对比桑黄样品的分子网络图形与每个桑黄样品的分子网络图形，即可判断是否属于同一基原。本发明将UPLC‑Q‑TOF‑MSE与非依赖模式采集数据结合，实现了桑黄的FBMN构建及不同基原桑黄的区分，还可区分特定组分在不同基原桑黄中的含量，为桑黄的基原鉴定及成分利用提供了新的思路和方法。

说明书

技术领域

本发明涉及桑黄基原鉴定的技术领域，尤其涉及一种区分不同基原桑黄类真菌的方法与应用。

背景技术

桑黄是我国著名的药用真菌，最早源于我国汉代的《神农本草经》。其中记载“桑耳，黑者，主女子漏下赤白汁，血病癥瘕积聚，阴痛，阴阳寒热无子。五木耳，名檽，益气不饥，轻身强志。生山谷。”现代药理学研究表明，其具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血糖等多种活性。民间常用的桑黄类真菌包括桑黄孔菌属(Sanghuangporus)、纤孔菌属(Inonotus)和热带孔菌属(Tropicoporus)的多个种，由于外观相似且不易通过性状进行鉴定，市场上基原混淆严重。

桑黄类真菌可生长于桑树、杨树、柳树、栎树等多种树木上，生长于桑树上的只有桑树桑黄一种，药用价值高，但是野生资源稀缺。由于生长环境的多样性，不同种桑黄类真菌的化学成分和药理活性均有较大差异，市场经济价值也有较大差异。目前桑黄的基原鉴定多通过性状鉴别或者ITS鉴定。性状鉴别虽然简便易行，但多依靠经验，缺乏明确的判断标准。ITS鉴定通过提取样本DNA进行扩增测序后，与数据库中已知序列进行比对进行鉴定，准确性较高，但操作繁琐；且野生桑黄多木质化，DNA提取困难。因此探索一种简便直观的方法实现不同基原桑黄的区分具有重要意义。

质谱分子网络(molecular networking，MN)根据结构相似的天然产物分子产生相似的碎片离子，通过检索数据库和设定二级碎片的相似度阈值将所采集的质谱数据整合为一张可视化的分子网络图，每个节点代表一个碎片离子，结构相似的化合物会聚集成分子簇并以线(边)相互连接。由于不同基原的桑黄存在化学成分的差异性，其分子网络图所呈现的节点、分子簇和边均会有所不同。经典的质谱分子网络构建中采用DDA(数据依赖采集模式)进行数据采集，即在进行一级质谱分析后，根据设定的筛选条件筛选母离子进行二级质谱分析，可获得更多的碎片信息。该方法筛选目标离子采用的窗口较窄，在一定上可减少干扰离子的存在，但会造成部分信息的缺失。基于特征的质谱分子网络(feature-basedmolecular networking，FBMN)采用DIA(数据非依赖采集模式)进行数据采集，通过高低碰撞能量进行一级质谱和碎片信息的交替采集，不需要对母离子进行筛选，利用若干个窗口对质谱进行全范围扫描，对每个窗口中的所有离子进行快速、循环选择和检测，理论上可以获得样本中所有离子的全部碎片信息，提高了数据利用度，缺失值更少，分析重复性更高。在构建可视化分子网络的同时，FBMN能够实现对目标成分的相对定量分析。近年来，MN广泛应用于天然产物的发现与鉴定领域，尚未有FBMN在桑黄类真菌基原鉴定方面的研究和应用。

发明内容

本申请针对现有技术的不足，本发明提供了一种区分不同基原桑黄类真菌的方法与应用。本发明利用基于特征的质谱分子网络技术区分不同基原桑黄类真菌，所述方法可以建立每种桑黄类真菌的可视化图形，同时能够直观快速区分不同基原的桑黄类真菌，还可以对区分每种组分在不同基原桑黄类真菌中的含量，为桑黄的基原鉴定及成分的利用提供了一种新的思路和方法。

本发明的技术方案如下：

本发明首先保护一种区别不同基原桑黄类真菌的方法，所述方法如下：

(1)桑黄样品前处理；

(2)采用UPLC-Q-TOF-MSE(超高效液相色谱单四级杆飞行时间串联质谱仪联用系统)进行DIA(数据非依赖模式采集)数据采集；

(3)将步骤(2)采集的数据分别进行基于特征的质谱分子网络构建及可视化(每种基原桑黄的数据分别导入处理)，得到每个桑黄的分子网络图形作为标准图形。

(4)将步骤(2)采集的不同基原桑黄的数据同时进行基于特征的质谱分子网络构建及可视化(将所有待测桑黄的数据同时导入处理)，得到桑黄样品的分子网络图形；

(5)对比步骤(4)得到的分子网络图形与每个桑黄样品的分子网络图形，判断是否属于同一种桑黄类真菌，如果分子网络图形相同，则属于同一种桑黄类真菌；否则就不属于同一种桑黄类真菌。

进一步地，所述不同基原是指不同物种，即不同桑黄菌种。

进一步地，步骤(1)中，所述桑黄包括桑树桑黄Sanghuangporus Sanghuang、杨树桑黄Sanghuangporus vaninii、暴马桑黄Sanghuangporus baumii中的一种或多种。

进一步地，步骤(1)中，所述样品前处理的方法为：分别将不同基原的桑黄粉碎得到桑黄粉末，加入溶剂进行超声处理，得到桑黄样品。

进一步地，步骤(1)中，所述桑黄粉末与溶剂的质量体积比为0.01-0.05g：1mL，所述桑黄粉末与溶剂的质量体积比优选0.02g：1mL；所述溶剂为甲醇；所述超声的时间为10-60min，所述超声的时间优选30min。

进一步地，步骤(2)中，所述UPLC-Q-TOF-MSE中超高效液相色谱的色谱柱为硅胶基反相超高效液相色谱柱，优选地，所述UPLC-Q-TOF-MSE中超高效液相色谱的色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，100mm×2.1mm,1.7μm；流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈。

进一步地，所述甲酸水溶液中甲酸的体积浓度为0.1-0.5％，超高效液相色谱采用梯度洗脱，流速为0.25-0.4mL/min，进样体积为5-10μL；所用色谱柱的柱温为30-40℃。

进一步地，所述洗脱梯度的方法如下：0-3min，5％流动相B；3-5min，5％→15％流动相B(流动相B的比例由5％变为15％)；5-9min，15％流动相B；9-15min，15％→25％流动相B(流动相B的比例由15％变为25％)；15-28min，25％→80％流动相B(流动相B的比例由25％变为80％)；28-28.1min，80％→5％流动相B(流动相B的比例由80％变为5％)；28.1-30min，5％流动相B。

进一步地，优选条件为：采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm)，以0.5％甲酸水溶液(流动相A)和乙腈(流动相B)为流动相进行梯度洗脱，柱温为35℃；流速为0.3mL/min；进样体积为5μL。

进一步地，步骤(2)中，所述UPLC-1-TOF-MSE中质谱采用单四级杆串联飞行时间质谱仪，电喷雾电离源，负离子模式。参数如下：质量扫描范围50-1500Da；锥孔电压40V；离子源温度120℃；毛细管电压3.5kV；脱溶剂气为N

进一步地，步骤(3)中，所述基于特征的质谱分子网络构建及可视化的具体方法如下：将UPLC-Q-TOF-MSE所采集的原始数据导入Progenesis QI(液质连用数据分析)软件进行预处理，然后选择导出化合物测量表(compound measurement，CSV格式)作为特征量化表(feature quantification table)，导出碎片数据集(fragment database，MSP格式)作为MS/MS光谱摘要(MS/MS spectral summary)，分别上传至全球天然产物分子网络(GNPS)平台基于特征的分子网络(FBMN)模块的相应位置后提交分析，参数设置如下：precursor ionmass tolerance and fragment ion mass tolerance，0.02Da；minimum cosine score，0.7；minimum matched fragment ions，6；maximum number of neighbor nodes for onesingle node，10；maximum size of a spectral family,100。将得到的数据导入Cytoscape软件进行可视化处理。

本发明还保护一种桑黄类样品的FBMN构建方法，所述方法如下：

(1)桑黄样品前处理；

(2)采用UPLC-Q-TOF-MSE(超高效液相色谱单四级杆飞行时间串联质谱仪联用系统)进行DIA(数据非依赖模式采集)数据采集；

(3)将采集的数据进行基于特征的质谱分子网络构建及可视化，得到分子网络图形。

本发明还保护一种上述方法在区分不同品种桑黄类真菌中活性成分种类及每种活性组分在不同基原桑黄中含量对比的应用，应用的具体方法为：按上述方法，采用UPLC-Q-TOF-MSE进行DIA数据采集；得到每种桑黄类真菌的数据，将采集不同基原桑黄类真菌所得到UPLC-Q-TOF-MSE原始数据一起导入Progenesis QI软件进行预处理，包括质谱峰提取，解卷积，峰对齐及峰面积归一化处理，选择导出compound measurement(CSV格式)作为feature quantification table，导出fragment database(MSP格式)MS/MS spectralsummary，分别上传至GNPS平台FBMN模块的相应位置后提交分析。参数设置如下：precursorion mass tolerance and fragment ion mass tolerance，0.02Da；minimum cosinescore，0.7；minimum matched fragment ions，6；maximum number of neighbor nodesfor one single node，10；maximum size of a spectral family,100。将得到的数据导入Cytoscape软件进行饼状图可视化处理，将不同基原的桑黄设置为不同的颜色，对比每个组分中不同颜色的占比，即可比较该组分在不同基原桑黄中的含量，具体地，将precursormass一栏按照数值高低排序，检索目标成分的母离子或特征碎片所对应的质荷比数值，选中后，该节点轮廓变为黄色，在图中找出后即可直观比较目标成分在不同桑黄中的相对含量高低。

本发明有益的技术效果在于：

本发明首次采用UPLC-Q-TOF-MS结合基于特征的质谱分子网络(FBMN)实现桑黄类真菌质谱分子网络的建立以及实现不同种桑黄类真菌的区分。本发明样本及数据处理方法简便，无需进行任何指标成分的定性定量，即可快速直观的进行桑黄类真菌的基原区分。

本发明所述方法不仅实现了不同品种桑黄类真菌的鉴定，同时可以实现不同品种桑黄类真菌中活性成分含量的直观比较，从而得知该活性组分在何种桑黄类真菌的相对含量更多，为桑黄类真菌的有效利用提供了新的思路。

附图说明

图1为本发明桑树桑黄总离子流图。

图2为本发明桑树桑黄FBMN图。

图3为本发明杨树桑黄总离子流图。

图4为本发明杨树桑黄FBMN图。

图5为本发明暴马桑黄总离子流图。

图6为本发明暴马桑黄FBMN图。

图7为本发明三种桑黄FBMN图。

图中：1、为化合物hispidin(C

图8为本发明图7中三种FBMN部分节点的放大图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

本发明首先进行桑黄类样品的FBMN构建方法，所述方法如下：

(1)桑黄样品前处理；

(2)采用UPLC-Q-TOF-MSE(超高效液相色谱单四级杆飞行时间串联质谱仪联用系统)进行DIA(数据非依赖模式采集)数据采集；

(3)将采集的数据进行基于特征的质谱分子网络构建及可视化，得到分子网络图形。

本发明还涉及一种区别不同基原桑黄类真菌的方法，所述方法如下：

(1)桑黄样品前处理；

(2)采用UPLC-Q-TOF-MSE(超高效液相色谱单四级杆飞行时间串联质谱仪联用系统)进行DIA(数据非依赖模式采集)数据采集；

(3)将步骤(2)采集的数据分别进行基于特征的质谱分子网络构建及可视化，得到每个桑黄的分子网络图形作为标准图形。

(4)将步骤(2)采集的不同基原桑黄的数据同时进行基于特征的质谱分子网络构建及可视化，得到桑黄样品的分子网络图形；

(5)对比步骤(4)得到的分子网络图形与每个桑黄样品的分子网络图形，判断是否属于同一种桑黄类真菌，如果分子网络图形相同，则属于同一种桑黄类真菌；否则就不属于同一种桑黄类真菌。

在本发明中，所述不同基原是指不同物种，即不同桑黄菌种。

在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述桑黄为桑树桑黄和杨树桑黄；桑树桑黄和暴马桑黄；桑树桑黄、杨树桑黄和暴马桑黄或杨树桑黄和暴马桑黄。

在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述样品前处理的方法为：分别将不同基原的桑黄粉碎得到桑黄粉末，加入溶剂进行超声处理，得到桑黄样品。

在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述桑黄粉末与溶剂的质量体积比为0.01g：1mL、0.02g：1mL或0.05g：1mL，所述桑黄粉末与溶剂的质量体积比优选0.02g：1mL；所述溶剂为甲醇；所述超声的时间为10min、15min、30min或60min，所述超声的时间优选30min。

步骤(2)中，所述UPLC-Q-TOF-MSE中超高效液相色谱的色谱柱为硅胶基反相超高效液相色谱柱，在本发明的一个实施例中，所述UPLC-Q-TOF-MSE中超高效液相色谱的色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，100mm×2.1mm,1.7μm；流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈。

在本发明的一个实施例中，所述甲酸水溶液中甲酸的体积浓度为0.1、0.2％、0.3％或0.5％，超高效液相色谱采用梯度洗脱，流速为0.25mL/min、0.3mL/min、0.35mL/min或0.4mL/min，进样体积为5μL、8μL、10μL；所用色谱柱的柱温为30℃、35℃或40℃。

在本发明的一个实施例中，所述洗脱梯度的方法如下：0-3min，5％流动相B；3-5min，5％→15％流动相B(流动相B的比例由5％变为15％)；5-9min，15％流动相B；9-15min，15％→25％流动相B(流动相B的比例由15％变为25％)；15-28min，25％→80％流动相B(流动相B的比例由25％变为80％)；28-28.1min，80％→5％流动相B(流动相B的比例由80％变为5％)；28.1-30min，5％流动相B。

在本发明的一个实施例中，优选条件为：采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm)，以0.5％甲酸水溶液(流动相A)和乙腈(流动相B)为流动相进行梯度洗脱，柱温为35℃；流速为0.3mL/min；进样体积为5μL。

在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述UPLC-1-TOF-MSE中质谱采用单四级杆串联飞行时间质谱仪，电喷雾电离源，负离子模式。参数如下：质量扫描范围50-1500Da；锥孔电压40V；离子源温度120℃；毛细管电压3.5kV；脱溶剂气为N

在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述基于特征的质谱分子网络构建及可视化的具体方法如下：将UPLC-Q-TOF-MSE所采集的原始数据导入Progenesis QI(液质连用数据分析)软件进行预处理，然后选择导出化合物测量表(compound measurement，CSV格式)作为特征量化表(feature quantification table)，导出碎片数据集(fragmentdatabase，MSP格式)作为MS/MS光谱摘要(MS/MS spectral summary)，分别上传至全球天然产物分子网络(GNPS)平台基于特征的分子网络(FBMN)模块的相应位置后提交分析，参数设置如下：precursor ion mass tolerance and fragment ion mass tolerance，0.02Da；minimumcosine score，0.7；minimum matched fragment ions，6；maximum number ofneighbor nodes for one single node，10；maximum size of a spectral family,100。将得到的数据导入Cytoscape软件进行可视化处理。

本发明还保护一种上述方法在区分不同品种桑黄类真菌中活性成分种类及每种活性组分在不同基原桑黄中含量对比的应用，应用的具体方法为：按上述方法，采用UPLC-Q-TOF-MSE进行DIA数据采集；得到每种桑黄类真菌的数据，将采集不同基原桑黄类真菌所得到UPLC-Q-TOF-MSE原始数据一起导入Progenesis QI软件进行预处理，包括质谱峰提取，解卷积，峰对齐及峰面积归一化处理，选择导出compound measurement(CSV格式)作为feature quantification table，导出fragment database(MSP格式)MS/MS spectralsummary，分别上传至GNPS平台FBMN模块的相应位置后提交分析。参数设置如下：precursorion mass tolerance and fragment ion mass tolerance，0.02Da；minimum cosinescore，0.7；minimum matched fragment ions，6；maximum number of neighbor nodesfor one single node，10；maximum size of a spectral family,100。将得到的数据导入Cytoscape软件进行饼状图可视化处理，将不同基原的桑黄设置为不同的颜色，对比每个组分中不同颜色的占比，即可比较该组分在不同基原桑黄中的含量，具体地，将precursormass一栏按照数值高低排序，检索目标成分的母离子或特征碎片所对应的质荷比数值，选中后，该节点轮廓变为黄色，在图中找出后即可直观比较目标成分在不同桑黄中的相对含量高低。

下面通过实施例对本发明做进一步阐述和说明。

实施例1

本实施例提供了一种桑黄类真菌(桑树桑黄)的FBMN构建方法。具体包括：

(1)桑黄样品前处理

桑树桑黄子实体打粉，过三号筛；称取粉末1g，加入甲醇50ml，250W、53KHz超声处理30min；以0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液上机分析。

(2)使用UPLC-Q-TOF-MSE进行数据非依赖模式采集

Waters AcquityTM超高效液相色谱系统；Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm)；以0.5％甲酸水溶液(流动相A)和乙腈(流动相B)为流动相进行梯度洗脱，洗脱梯度如下:0-3min,5％B；3-5min,5％→15％B；5-9min,15％B；9-15min,15％→25％B；15-28min,25％→80％B；28-28.1min,80％→5％B；28.1-30min,5％B；柱温35℃；流速0.3mL/min；进样体积5μL。

质谱采用Waters Xevo G2单四级杆飞行时间质谱仪配置电喷雾电离源，负离子模式。参数如下：质量扫描范围50-1500Da；锥孔电压40V；离子源温度120℃；毛细管电压3.5kV；脱溶剂气为N

锥孔气为N

(3)将UPLC-Q-TOF-MSE所采集的桑树桑黄原始数据(.raw格式)导入ProgenesisQI软件进行预处理，包括质谱峰提取，解卷积，峰对齐及峰面积归一化处理，选择导出compound measurement(CSV格式)作为feature quantification table，导出fragmentdatabase(MSP格式)作为MS/MS spectral summary,分别上传至GNPS平台FBMN模块的相应位置后提交分析。参数设置如下：precursor ion mass tolerance and fragment ionmass tolerance，0.02Da；minimum cosine score，0.7；minimum matched fragment ions，6；maximum number of neighbor nodes for one single node，10；maximum size of aspectral family,100。将得到的数据导入Cytoscape软件进行可视化处理。所得到的桑树桑黄FBMN图如图2所示。桑树桑黄的FBMN图共包括165个节点，198条边，7个分子簇。

实施例2

本实施例提供了一种桑黄类真菌(杨树桑黄)的FBMN构建方法。具体方法与实施例1相同。

所采集的杨树桑黄总离子流图如图3所示，所得到的杨树桑黄FBMN如图4：杨树桑黄的FBMN图共包括298个节点，447条边，15个分子簇。

实施例3

本实施例提供了一种桑黄类真菌(暴马桑黄)的FBMN构建方法。具体方法与实施例1相同。

所采集暴马桑黄总离子流图如图5；所得到的暴马桑黄FBMN图6所示，暴马桑黄的FBMN图共包括478个节点，646条边，20个分子簇。

实施例4

本实施例提供了一种桑黄类真菌(桑树桑黄)的FBMN构建方法。具体包括：

(1)桑黄样品前处理

桑树桑黄子实体打粉，过三号筛；称取粉末0.5g，加入甲醇50ml，超声处理10min；以0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液上机分析。

(2)使用UPLC-Q-TOF-MSE进行数据非依赖模式采集

Waters AcquityTM超高效液相色谱系统；Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm)；以0.1％甲酸水溶液(流动相A)和乙腈(流动相B)为流动相进行梯度洗脱，洗脱梯度如下:0-3min,5％B；3-5min,5％→15％B；5-9min,15％B；9-15min,15％→25％B；15-28min,25％→80％B；28-28.1min,80％→5％B；28.1-30min,5％B；柱温30℃；流速0.25mL/min；进样体积10μL。

质谱采用Waters Xevo G2单四级杆飞行时间质谱仪配置电喷雾电离源，负离子模式。参数如下：质量扫描范围50-1500Da；锥孔电压40V；离子源温度120℃；毛细管电压3.5kV；脱溶剂气为N

锥孔气为N

(3)将UPLC-Q-TOF-MSE所采集的桑树桑黄原始数据(.raw格式)导入ProgenesisQI软件进行预处理，包括质谱峰提取，解卷积，峰对齐及峰面积归一化处理，选择导出compound measurement(CSV格式)作为feature quantification table，导出fragmentdatabase(MSP格式)作为MS/MS spectral summary,分别上传至GNPS平台FBMN模块的相应位置后提交分析。参数设置如下：precursor ion mass tolerance and fragment ionmass tolerance，0.02Da；minimum cosine score，0.7；minimum matched fragment ions，6；maximum number of neighbor nodes for one single node，10；maximum size of aspectral family,100。将得到的数据导入Cytoscape软件进行可视化处理。所得到的桑树桑黄FBMN图。

实施例5

本实施例提供了一种桑黄类真菌(桑树桑黄)的FBMN构建方法。具体包括：

(1)桑黄样品前处理

桑树桑黄子实体打粉，过三号筛；称取粉末2.5g，加入甲醇50ml，超声处理60min；以0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液上机分析。

(2)使用UPLC-Q-TOF-MSE进行数据非依赖模式采集

Waters AcquityTM超高效液相色谱系统；Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm)；以0.3％甲酸水溶液(流动相A)和乙腈(流动相B)为流动相进行梯度洗脱，洗脱梯度如下:0-3min,5％B；3-5min,5％→15％B；5-9min,15％B；9-15min,15％→25％B；15-28min,25％→80％B；28-28.1min,80％→5％B；28.1-30min,5％B；柱温40℃；流速0.4mL/min；进样体积5μL。

质谱采用Waters Xevo G2单四级杆飞行时间质谱仪配置电喷雾电离源，负离子模式。参数如下：质量扫描范围50-1500Da；锥孔电压40V；离子源温度120℃；毛细管电压3.5kV；脱溶剂气为N

锥孔气为N

(3)将UPLC-Q-TOF-MSE所采集的桑树桑黄原始数据(.raw格式)导入ProgenesisQI软件进行预处理，包括质谱峰提取，解卷积，峰对齐及峰面积归一化处理，选择导出compound measurement(CSV格式)作为feature quantification table，导出fragmentdatabase(MSP格式)作为MS/MS spectral summary,分别上传至GNPS平台FBMN模块的相应位置后提交分析。参数设置如下：precursor ion mass tolerance and fragment ionmass tolerance，0.02Da；minimum cosine score，0.7；minimum matched fragment ions，6；maximum number of neighbor nodes for one single node，10；maximum size of aspectral family,100。将得到的数据导入Cytoscape软件进行可视化处理。所得到的桑树桑黄FBMN图。

实施例6

本实施例提供了一种同时比较不同种桑黄及不同品种桑黄中活性成分的方法。具体方法为：将实施例1-3所得到UPLC-Q-TOF-MSE原始数据一起导入Progenesis QI软件进行预处理，包括质谱峰提取，解卷积，峰对齐及峰面积归一化处理，选择导出compoundmeasurement(CSV格式)作为feature quantification table，导出fragment database(MSP格式)MS/MS spectral summary，分别上传至GNPS平台FBMN模块的相应位置后提交分析。参数设置如下：precursor ion mass tolerance and fragment ion mass tolerance，0.02Da；minimum cosine score，0.7；minimum matched fragment ions，6；maximumnumber of neighbor nodes for one single node，10；maximum size of a spectralfamily,100。将得到的数据导入Cytoscape软件进行饼状图可视化处理，如图7所示，共包含572个节点(即前体离子)。在Cytoscape中将不同基原的桑黄设置为不同的颜色，将precursor mass一栏按照数值高低排序，检索目标成分的母离子或特征碎片所对应的质荷比数值，选中后，该节点轮廓变为黄色，在图中找出后即可直观比较目标成分的含量高低。

以图8节点为例，节点1为化合物hispidin的母离子，即m/z 245，直观比较可知该成分在杨树桑黄中含量最高，其次为暴马桑黄，而桑树桑黄中不含有该成分。节点2为davallialactone的母离子，即m/z 463，直观比较可知该成分在桑树桑黄中含量最高，其次为暴马桑黄，杨树桑黄中含量最少。节点3为hypholomine B的母离子，即m/z 489，直观比较可知该成分在杨树桑黄中含量最高，其次为桑树桑黄和暴马桑黄。同时，通过对节点的分析，还可知道特定成分在三种桑黄中的具体占比，比如图8中1所示化合物hispidin的母离子在三种桑黄中，杨树桑黄的占比为93.7％，暴马桑黄中占比6.3％，说明该化合物在杨树桑黄中含量较高，桑树桑黄不含该物质，因此，在涉及该物质的提取或应用中不用考虑桑树桑黄；2所示化合物davallialactone的母离子在三种桑黄中，桑树桑黄的占比为82.9％，暴马桑黄的占比为16.4％，杨树桑黄中占比0.7％；3所示化合物hypholomine B的母离子在三种桑黄中，杨树桑黄的占比为94.9％，暴马桑黄的占比为2.5％，桑树桑黄中占比2.6％。

本发明所述方法可以提供不同品种桑黄的区分，以及不同品种桑黄中活性成分的占比情况，为桑黄类真菌的品种鉴别提供了新的思路，为其活性成分的合理开发利用提供科学依据。以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。