一种新的CHO细胞表达重组人神经生长因子的纯化方法

摘要

本发明公开了一种新的CHO细胞表达重组人神经生长因子的纯化方法，包括步骤：阴离子交换层析过程，CHO培养物上清液经除菌过滤后上样至阴离子层析填料中，收集阴离子层析流穿产物，实现阴离子交换层析；疏水作用层析过程，阴离子层析流穿物上样到疏水层析填料中，经洗脱液洗脱后，收集得到重组人神经生长因子。本发明经两步层析后，可得到纯度高达99％的产物，且回收率大于95％，本发明的重组人神经生长因子的纯化方法步骤少、周期短，具有广阔的工业生产前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药纯化领域，具体为一种新的CHO细胞表达重组人神经生长因子的纯化方法。

背景技术

人神经生长因子(hNGF)，是指具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。由于神经生长因子的重要性以及人体内合成的微量性，利用人工手段合成hNGF已经是不可替代的趋势。通过基因工程技术在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达重组人生长因子是合成hNGF的重要手段。然而，CHO表达上清液中的含有许多杂质，例如HCP、HCD、NGF变异体等，必须经过严格的纯化才能使用。

目前对CHO表达重组人神经生长因子的纯化方法主要公开的有：

1、中国专利CN113024655A公开了一种高效去除rhNGF前体的纯化方法，其采用羟基磷灰石层析进行前体物质的分离，但该专利并未提及产物回收率及纯度，且羟基磷灰石层析前保留了离子交换层析、疏水层析等一步或多步层析手段，工艺步骤增多，生产周期延长。

2、中国专利CN102702341A公开了基于CHO细胞表达系统的重组人神经生长因子纯化方法，其采用阳离子交换和分子筛两步层析的工艺制备了纯度大于98％(Tricine-SDS-PAGE电泳法)的重组人神经生长因子，但分子筛上样样品需要经过超滤浓缩，且上样载量需≤4％柱体积，不适于工业化生产。

3、中国专利CN106478801A公开了一种从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其采用阳离子交换及疏水作用两步层析方法制备了纯度大于99％、回收率大于71.4％的重组人神经生长因子，但疏水层析洗脱时时采用了线性梯度洗脱，对设备要求较高，不利于大规模工业生产。

4、中国专利CN108239146A公开了一种高纯度rhNGF的制备方法，其在阳离子洗脱和疏水洗脱前增加了清洗步骤，避免线性洗脱的问题，但是阳离子上样前必须经过一步或多步层析，增加了生产周期。

由于CHO细胞表达系统费用相对昂贵，如果使用传统的纯化工艺势必对蛋白的得率、活性以及时间损耗上存在巨大劣势，进而提高产品成本，这也是一直影响CHO细胞表达重组人神经生长因子的工业化生产的主要原因。

基于上述可知，现有重组人神经生长因子的纯化技术大多步骤繁琐，同时存在着收率低、周期长等劣势，并不适用于重组人神经生长因子的规模化生产。因此，开发一种适用于CHO细胞系统表达重组人神经生长因子的高纯度、高回收率且周期短、成本低的纯化工艺刻不容缓。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的CHO细胞表达重组人神经生长因子的纯化方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种新的CHO细胞表达重组人神经生长因子的纯化方法，包括

S1：阴离子交换层析过程，CHO培养物上清液经除菌过滤后上样至阴离子层析填料中，收集阴离子层析流穿产物，实现阴离子交换层析；

S2：疏水作用层析过程，阴离子层析流穿物上样到疏水层析填料中，经洗脱液洗脱后，收集得到重组人神经生长因子。

优选的，S1中CHO培养物为表达重组人神经生长因子的CHO细胞培养物，该细胞培养物经4000rpm、10min离心后除去细胞及细胞碎片，收集得到上清液。

优选的，S1中除菌过滤中使用的除菌过滤膜孔径为0.22μm，其材质为PES。

优选的，S1中上样至阴离子层析填料中的细胞上清pH范围在6.5-8.5，电导＜5.000mS/cm。

优选的，S1中中上样到阴离子层析填料中的重组人神经生长因子载量为1.0-2.0mg/ml，S1中阴离子层析填料为强季铵(Q)阴离子交换介质。

优选的，S1中上样前阴离子层析柱经25mM Tris-HCl平衡10CV，其中25mM Tris-HCl，pH6.5-8.5，电导＜5.000mS/cm。

优选的，S2中上样到疏水层析填料中的阴离子流穿液pH6.0-8.0，盐浓度0.8-1.5M，其中盐为NaCl、KCl或(NH

优选的，S2中疏水层析填料其配基为丁基或苯基，S2中上样到疏水层析填料中的重组人神经生长因子载量为3.0-5.0mg/ml。

优选的，S2中上样前疏水层析填料经20mM PB平衡10CV，其中20mM PB，pH6.0-8.0，盐浓度0.8-1.5mol/L，其中盐为NaCl、KCl或(NH

优选的，S2中疏水层析的洗脱条件为线性洗脱，线性条件为降低的盐浓度梯度，其中盐浓度为0.5-1.5mol/L，洗脱体积10-30CV，其中盐为NaCl、KCl或(NH

优选的，上述线性洗脱中洗脱液含有5％-25％的醇，且醇为甲醇、乙醇或异丙醇中任意一种。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明的方法工艺步骤更少，缩短了生产周期且降低了样品污染几率。同时，流穿模式的阴离子层析作用对HCP、HCD有显著去除作用，同时对样品中的病毒有一定的去除效果。疏水层析条件下，NGF变异体得到有效去除，大大提高了NGF的纯度。

2、本发明的纯化方法简单、高效，且步骤少、周期短，适用于规模化生产。经两步层析后，可以得到纯度大于99％且回收率大于95％的产物。

附图说明

图1为实施例1中阴离子交换层析图谱；

图2为实施例2中疏水层析图谱；

图3为实施例2中疏水产物SEC-HPLC分析结果图谱。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：阴离子交换层析，如图1所示：

用5000rpm、10min离心表达重组人神经生长因子的CHO细胞培养物，以除去细胞及细胞碎片，收集得到上清液。再使用孔径大小为0.22μm除菌过滤器对上清液进行除菌过滤，收集过滤液。

使用

具体层析步骤为：

(1)清洗：用1M NaOH，流速0.94ml/min，冲洗Capto

(2)预平衡：用1M NaCl，流速0.94ml/min，冲洗Capto

(3)平衡：用25mM Tris-HCl缓冲液，流速0.94ml/min，冲洗Capto

(4)上样：调节细胞上清液样品至pH8.0，电导小于5.000mS/cm，以流速0.94ml/min上样，上样载量为1mg/ml，检测波长280nm，收集UV大于15mAU的流穿液；

(5)平衡：用25mM Tris-HCl缓冲液，流速0.94ml/min，冲洗Capto

(6)再生：用1M NaCl，流速0.94ml/min，冲洗Capto

(7)清洗：用1M NaOH，流速0.94ml/min，冲洗Capto

保存：用20％乙醇，流速0.94ml/min，冲洗Capto

实施例2：疏水作用层析，如图2所示：

使用

具体层析步骤为：

(1)清洗：用超纯水，流速1.00ml/min，冲洗HiTrap Phenyl HP树脂柱3个柱体积；

(2)平衡：用Buffer A(20mM PB+1M NaCl,pH7.0)，流速1.00ml/min，冲洗HiTrapPhenyl HP树脂柱10个柱体积至基线平稳；

(3)上样：调节实施例1阴离子流穿液样品至pH7.0，电导89.00mS/cm，以流速1.00ml/min进行上样；

(4)平衡：用Buffer A(20mM PB+1M NaCl,pH7.0)，流速1.00ml/min，冲洗HiTrapPhenyl HP树脂柱5个柱体积至基线平稳；

(5)洗脱：用Buffer A(20mM PB+1M NaCl,pH7.0)，Buffer B(20mM PB+20％乙醇,pH7.0)，以流速1.00ml/min进行线性洗脱，线性洗脱梯度为Buffer A100％-0％，Buffer B0％-100％，洗脱体积为20CV。收集Buffer B线性范围58％-87％、同时UV大于10mAu的洗脱液；

(6)再生：用0.5M NaCl，流速1.00ml/min，冲洗HiTrap Phenyl HP树脂柱3个柱体积；

(7)清洁：使用0.01M NaOH，流速0.2ml/min，冲洗2CV后暂停15min，继续冲洗1CV，以去除结合非常紧密、沉淀或变性的杂质；

(8)冲洗：用超纯水，流速0.2ml/min，冲洗HiTrap Phenyl HP树脂柱3个柱体积；

(9)保存：用20％乙醇，流速1.00ml/min，冲洗HiTrap Phenyl HP树脂柱3个柱体积。

综合实施例1、实施例2，采用SEC-HPLC方法分析经一步除菌和两步层析后收获的重组人神经生长因子的纯度。如图3检测结果显示，经过本发明所述的纯化工艺，可得到纯度大于99％的产物，同时产物回收率大于95％。

综上所述，本发明的方法工艺通过两步层析的方式制备得到了高纯度的重组人神经生长因子产物，产物回收率高，纯化步骤较少且生产周期短，可实现工业化生产，具有良好的市场应用前景。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。