重组人神经生长因子在大肠杆菌中的诱导表达及其分离纯化研究

摘要

人神经生长因子（human nerve growth factor，简称hNGF）是人体中一种对正常神经细胞有营养作用，对损伤神经修复机能有调节作用的生物活性因子，它可维持交感神经和感觉神经的生存，促进神经细胞的分化，决定轴突的伸展方向。对促进大脑的发育，神经系统的生长，损伤神经的再生和功能恢复具有决定性作用。 hNGF的 β亚基单体有118个氨基酸，有3对活性必需的链内二硫键，这三对二硫键使其在作为包涵体表达时复性困难，生物活性不稳定；用分泌系统表达时容易造成溶菌、活性和回收率非常低等问题，使其产业化的进程非常缓慢。大肠杆菌表达系统作为基因工程研究最早开发的安全、经典的标准化表达系统，具有其他表达系统所不具备的明显优势。但大肠杆菌表达系统仍然具有不完善的地方，如蛋白表达时易形成不正确折叠，导致部分蛋白质失活，影响生物活性等。为了有效表达rhNGF，本课题将rhNGF与大肠杆菌硫氧还蛋白进行融合表达，硫氧还蛋白引导其后的蛋白正确折叠，呈可溶性表达，具有天然生物学活性。 课题研究了rhNGF的表达载体构建、在大肠杆菌中的表达和分离纯化及结构和生物活性分析。经发酵工艺研究，融合蛋白表达量约占总蛋白的17.5％；纯化后，蛋白的纯度可达到95％以上，活性为4.0×104 U/ml左右，比活性约为1.2×105 U/mg，活性回收率为26％。样品经过Western blot试验、质谱分析、园二色谱等分析，结果证明本课题构建的工程菌pTHNGF／JM109表达的rhNGF结构正确。 本课题完成了rhNGF的中试工艺研究，为以后实现产业化生产打下了坚实的基础。