猪肌内脂肪性状关联的分子标记、引物、试剂盒、方法及应用

摘要

本申请涉及猪肌内脂肪性状技术领域，具体涉及猪肌内脂肪性状关联的分子标记、引物、试剂盒、方法及应用。该猪肌内脂肪性状关联的分子标记，包括猪FGF10基因g.28770769C>T形成的核苷酸序列。该分子标记的CC基因型个体猪肌内脂肪含量高于其他基因型，选育CC基因型个体，有利于提高群体的肌内脂肪含量。

说明书

技术领域

本申请涉及猪肌内脂肪性状技术领域，具体涉及猪肌内脂肪性状关联的分子标记、引物、试剂盒、方法及应用。

背景技术

猪肉肌内脂肪含量(IMF)直接影响了猪肉口感和风味，是猪肉品质的重要评定指标，IMF的增加能够提高猪肉的嫩度和持水力，减少滴水损失，对肌肉风味有很大的影响。肌内脂肪分布在肌束内，或称为大理石状脂肪，其数量和分布对于提高肉的风味和美味性有明显帮助。然而，猪肉质性状较难活体测量，很难用常规育种技术进行遗传改良，因此寻找控制猪肉质性状(尤其是IMF)的关键分子遗传标记，应用于该性状的分子辅助育种，对提高猪肉品质性能具有重要意义。

发明内容

成纤维细胞生长因子10(fibroblast growth factor 10，FGF10)是唯一特异表达于白色脂肪中的成纤维生长因子，它能够调控脂肪细胞的发育和代谢、刺激前脂肪细胞增殖以促进脂肪生成。FGF10在重度肥胖人群的皮下脂肪、内脏脂肪和腹部脂肪中高表达。敲除山羊FGF10会抑制肌内前脂肪细胞的生成。FGF10过表达能够增强脂蛋白脂肪酶等转录因子的表达。而有关猪FGF10基因对肉质性状的影响还未见报道。

本申请发明人对硒都黑猪肌内脂肪含量(IMF)极端个体的背最长肌组织进行RNA-seq检测，发现FGF10基因差异表达，说明其可以作为影响肌内脂肪沉积的候选基因。实施例扩增了猪FGF10基因的部分核苷酸序列，对其进行SNP筛选、鉴定，并与猪IMF性状进行关联分析，获得了与猪IMF性状相关的新的分子标记。

为此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：

(1)：猪肌内脂肪性状关联的分子标记，包括猪FGF10基因g.28770769C>T形成的核苷酸序列。

(2)：一种核酸分子，所述核酸分子包括如猪FGF10基因g.28770769C>T形成的核酸分子。

(3)：猪肌内脂肪性状关联的分子标记引物，包括如SEQ ID NO.3所示的DNA分子和如SEQ ID NO.4所示的DNA分子。

(4)：一种核酸分子，由(3)所述的分子标记引物经PCR扩增而成，所述核酸分子的基因型与猪肌内脂肪性状关联。

(5)：一种试剂盒，包括(3)所述的分子标记引物以及其他PCR扩增所需试剂。

(6)：猪肌内脂肪性状的检测方法，包括：

获取待测猪基因组DNA；

通过(2)所述的分子标记引物进行PCR扩增；

根据扩增产物的核苷酸序列检测猪FGF10基因g.28770769C>T的基因型；

根据所述基因型确定所述猪肌内脂肪性状。

(7)：猪的筛选方法，包括(6)所述的检测方法。

(8)：(1)所述的分子标记、(2)所述的分子标记引物、(2)或(4)所述的核酸分子或(5)所述的试剂盒的应用，所述应用选自如下任一：

1)猪肌内脂肪性状检测与分析；

2)猪的筛选与育种。

与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：

本申请实施例以硒都黑猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行胶回收并且进行测序分析，分析其与猪FGF10基因的三种不同基因型与IMF性状的相关性，发现FGF10基因g.2877076处存在单核苷酸突变C>T，通过对该单核苷酸多态性位点的不同基因型与猪肌内脂肪性状进行关联分析，发现其与猪肌内脂肪性状相关联，可为硒都黑猪的分子标记辅助选育提供帮助。

附图说明

图1为本申请实施例提供的猪FGF10基因第一内含子的PCR扩增结果，M为DL2000Maker，泳道1-4为PCR产物。

图2为本申请实施例提供的猪FGF10基因g.28770769C>T的测序结果。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

为了更好地理解本申请而不是限制本申请的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

为研究猪肌内脂肪性状的关联的分子标记，本申请实施例对肌内脂肪含量高、低组猪背最长肌进行转录组测序，发现FGF10差异表达，通过扩增猪FGF10基因的部分核苷酸序列，利用该序列进行了多态性变异位点的筛选鉴定及与猪肌内脂肪性状的关联分析，发现FGF10基因g.2877076处存在单核苷酸突变C>T，通过对该单核苷酸多态性位点的不同基因型与猪肌内脂肪性状进行关联分析，发现其与猪肌内脂肪性状相关联。

为此，本申请实施例提供了猪肌内脂肪性状关联的分子标记，包括猪FGF10基因g.28770769C>T形成的核苷酸序列。其中，猪FGF10基因参考GenBank数据库中猪FGF10基因(GenBank登录号:NC_010458.4)。

在一些实施例中，所述分子标记的突变位点位于猪FGF10基因第一内含子中。

在一些实施例中，猪FGF10基因g.28770769位点，CC基因型个体肌内脂肪含量显著高于CT基因型个体和TT基因型个体，CT基因型显著高于TT基因型个体。

基于此，根据猪FGF10基因g.28770769C>T的基因型，可以对猪个体的猪肌内脂肪性状进行遗传标记，以利于选育高IMF含量的品种。

基于此，本申请实施例还提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括如猪FGF10基因g.28770769C>T形成的核酸分子。

在一些实施例中，所述核酸分子具有如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。通过确定如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，即可确定猪FGF10基因g.28770769C>T的基因型，对应于如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的499碱基处的基因型。

由此，参考GenBank数据库中猪FGF10基因(登录号:NC_010458.4)的DNA序列第一内含子设计特异引物(该引物的序列如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示)，以硒都黑猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行胶回收并且进行测序分析，得到如序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的基因片段。由此，本申请实施例还公开了一种猪肌内脂肪性状关联的分子标记引物，包括如SEQ ID NO.3所示的DNA分子和如SEQ ID NO.4所示的DNA分子。其中，“分子标记引物”是用来扩增包含猪肌内脂肪性状联锁的分子标记，例如SNPs的核苷酸序列，以分析该分子标记的基因型，从而得知猪的猪肌内脂肪性状。

基于此，本申请实施例还公开了一种核酸分子，由所述的分子标记引物经PCR扩增而成，所述核酸分子的基因型与猪肌内脂肪性状关联。

基于此，本申请实施例还公开了一种试剂盒，包括所述的分子标记引物以及其他PCR扩增所需试剂。

基于此，本申请实施例还公开了一种猪肌内脂肪性状的检测方法，包括：获取待测猪基因组DNA；通过所述的分子标记引物进行PCR扩增；根据扩增产物的核苷酸序列检测猪FGF10基因g.28770769C>T的基因型；根据所述基因型确定所述猪肌内脂肪性状。

基于此，本申请实施例还公开了一种猪的筛选方法，包括所述的检测方法。

基于此，本申请实施例还公开了所述的分子标记、所述的分子标记引物、所述的核酸分子或所述的试剂盒的应用，所述应用选自如下任一：

1)猪肌内脂肪性状检测与分析；

2)猪的筛选与育种。

现结合具体实例对本申请做进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本申请，但不构成对本申请的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。

一、猪基因组DNA的提取

本发明的试验猪品种为硒都黑猪，是以恩施黑猪、梅山猪、湖北白猪等为基础，由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所与湖北天之力优质猪育种有限公司历经12年联合培育而成的黑猪新品种。猪基因组DNA的提取采用北京擎科生物科技有限公司生产的基因组DNA试剂盒(按照试剂盒说明书进行操作)提取，具体步骤如下所述：(1)采取猪耳缘组织，用无菌手术剪刀剪碎、研磨充分，置于2mL离心管中，然后加入200μL Buffer GA，涡旋混匀。

(2)加入20μL Proteinase K，混匀后，56℃水浴至组织酶解到无颗粒感。

(3)加入200μL Buffer GB于消化液中，涡旋混匀，然后56℃水浴10min。

(4)加入200μL无水乙醇至消化液中，涡旋混匀。

(5)吸附柱置于收集管中，然后将上一步所得混合液转移至吸附柱中12000r/min离心1min。

(6)弃掉废液，将吸附柱放回收集管中，加入500μL Buffer WB1于吸附柱中，12000r/min离心30sec。

(7)弃掉废液，将吸附柱放回收集管中，加入500μL Buffer WB2于吸附柱中，12000r/min离心30sec。

(8)重复步骤(7)。

(9)弃掉废液，将吸附柱放回收集管中，12000r/min空管离心2min，将吸附柱置于室温放置几分钟，彻底晾干残留的漂洗液。

(10)将吸附柱置于一个新的1.5mL离心管中，向吸附膜中间加入50-100μLTEBuffer(提前在65℃中水浴加热)，室温放置5min，12000r/min离心2min，收集DNA溶液(洗脱体积应不少于50μL，体积过少会影响洗脱效率，为得到更多的DNA，可将得到的DNA溶液重新加入吸附柱中进行二次洗脱)。

(11)测DNA浓度后保存于4℃，长期保存须放置于-20℃。

二、猪FGF10目的片段序列的获取

1、PCR扩增

根据FGF10基因的基因组序列(GenBank登录号:NC_010458.4)设计以下引物对：

正向引物：5’TGAAATGTCTGTATGCTTA 3’，SEQ ID NO.3

反向引物：5’TCAAAGAAAGAACACAACT 3’，SEQ ID NO.4

利用上述引物在硒都黑猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系为30μL，体系中各组分的浓度为100ng模板DNA，2×PCR Mix 15μL、上述正反向引物各0.5μM，PCR的运行程序如下：预变性98℃，45sec，然后变性95℃，15sec，退火55℃，30sec，延伸72℃，20sec，35个循环；终延伸72℃，60sec。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，PCR产物的长度为805bp。

2、PCR产物纯化

采用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化，具体步骤见试剂盒说明书。

3、PCR产物测序、基因分型及多态性分布检测

将上述获得的PCR产物直接送到奥科公司进行测序，以检测分子标记。结果如图2所示，经检测PCR产物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，直接从测序图谱上进行多态性分布检测，在硒都黑猪中，FGF10基因g.28770769C>T位点表现为CC、CT、TT三种基因型，C等位基因频率为0.52，属于优势等位基因。结果如表1所示。

表1 FGF10基因rg28770769C>T位点基因型频率和等位基因频率统计结果

三、本发明分子标记与猪肌内脂肪性状的关联分析及应用

用于关联分析的实验猪群为393头硒都黑猪，采用上述实验例所建立的PCR产物直接测序法进行多态性检测，用SAS统计软件中的GLM程序进行方差分析，分析猪FGF10基因三种不同基因型与猪肌内脂肪性状的相关性，利用REG程序计算基因的加性效应和显性效应，并且进行差异性检验。所采用的模型为：Y

关联分析结果如表2所示，在硒都黑猪群体中，g.28770769C>T位点显著影响IMF性状(P<0.05)，并且加性效应显著(P<0.05)。携带CC基因型个体的IMF显著高于TT基因型个体(P<0.05)，IMF存在CC>CT>TT的趋势，C等位基因是IMF性状的一个优势等位基因，在育种中应优先保留携带CC基因型的个体，有利于提高群体的肌内脂肪含量。

表2为该多态位点与硒都黑猪肌内脂肪沉积性状和肉质性状关联分析统计表

注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著P<0.05；基因型效应*表示差异显著P<0.05；μ：均值。SE：标准误差。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。