一种刺五加-树舌发挥镇静催眠作用成分确定及机制研究方法

摘要

本发明提供了一种刺五加‑树舌发挥镇静催眠作用成分的确定及机制研究方法，属于药物研究和分析领域。本发明利用UPLC‑MS/MS技术结合质谱数据库和文献分析刺五加‑树舌(5︰1)中的差异性成分，并对其进行纯化；基于UPLC‑MS/MS技术分析刺五加‑树舌总苯丙素提取物(AGTP)中的苯丙素类成分；应用PCPA诱导大鼠失眠模型，初步探究AGTP的镇静催眠作用及其作用机制，为后续深入研究刺五加‑树舌中的总苯丙素类成分发挥镇静催眠作用的机制提供思路与方向，也为开发具有镇静催眠作用的药物提供理论依据。

说明书

技术领域

本发明属于药物研究和分析领域，具体地说，涉及一种刺五加-树舌发挥镇静催眠作用成分机制研究方法。

背景技术

失眠是最常见的睡眠障碍之一，临床表现为夜晚入睡困难、睡眠持续时间过短、睡眠质量不高、常规性觉醒等。相关数据显示，全球范围内患有失眠的人数已经达到人口总数的30％。药物治疗是临床上治疗失眠最常用的方法。虽然临床上治疗失眠的药物有很多，但此类药物大部分都存在潜在的副作用，包括依赖性、嗜睡、药物耐受、健忘症、成瘾性和戒断反应，因此不建议长期服用。而市售药物安乐片(由八味中药材组成的中成药)、七叶神安分散片(主要成分为三七总皂苷)等虽具有比地西泮(DZP)更显著的镇静催眠作用，且副作用小，但起效时间慢，疗程较长。基于此，近年来，研究人员不断从天然药物中寻找出起效快、疗效确切且副作用小的镇静催眠药物。

中医“相须”配伍理论是指将药性、功能相同或相似的药物联合应用来明显增强本身的药效，相当于现代医学的协同作用。基于该理论，研究发现，刺五加-树舌配比为5︰1的醇提物对小鼠的镇静催眠作用优于单味给药组，其差热分析(DTA)曲线也不同于单味药。但并未对刺五加-树舌配伍使用药效增强的主要活性物质进行探究。

发明内容

本发明提供了一种刺五加-树舌发挥镇静催眠作用成分确定及机制研究的方法，能够对刺五加-树舌中的总苯丙素类成分进行快速、准确地鉴定和分析。结合动物实验和分析结果，能够更加深入地揭示总苯丙素类成分的镇静催眠作用机制，为相关药物的开发提供更加直接和详细的证据和参考。

为解决上述技术问题，本发明的刺五加-树舌发挥镇静催眠作用成分机制研究方法是通过下述步骤实现的：

分别提取刺五加、树舌、刺五加-树舌中的成分；

使用UPLC-MS/MS技术分析刺五加与树舌配伍前后的差异成分；

采用Thermo Scientific Xcalibur 3.1软件处理数据，按实际测得的相对分子质量与理论相对分子质量二者偏差小于5ppm的原则，确定各色谱峰对应化合物的分子式，并结合CompoundDiscover 2.1、MassBank、Human Metabolome Database(HMDB)、ChemSpider、PubChem等数据库和在PubMed与CNKI数据库中所检索到的相关文献，推测化学成分的结构和裂解规律，利用ChemDraw 18.1软件进行绘制成分结构；

通过峰数量和峰面积的对比，初步推断刺五加-树舌发挥镇静催眠作用的主要物质；

利用大孔树脂吸附法纯化刺五加-树舌总苯丙素(AGTP)；

使用UPLC-MS/MS技术分析AGTP中的苯丙素类成分；

将纯化得到的总苯丙素类成分与动物模型进行实验；

建立动物模型：将Wistar大鼠随机分为空白组和造模组，造模组大鼠以300mg/kg给药剂量腹腔注射(i.p.)PCPA混悬液，于每日上午8:30～9:00进行，连续注射3天，每次注射结束后，均用75％乙醇擦拭伤口，避免感染，空白组大鼠i.p.等量生理盐水；

将造模成功的失眠大鼠，随机分为模型组(n＝6)、DZP组(n＝6，4.0mg/kg)、AGTP高剂量组(AGTP-H，n＝7，9.45mg/kg)、AGTP中剂量组(AGTP-M，n＝7，6.30mg/kg)、AGTP低剂量组(AGTP-L，n＝7，3.15mg/kg)，空白组(n＝6)和模型组给予等体积生理盐水(1mL/100g)，其余组给予相应样品溶液，于每日上午8:30～9:30灌胃给药，每天1次，连续7天；

观察精神状态、毛发光泽变化、对外界刺激的反应；

记录各组大鼠给药前后体质量，计算各组大鼠体质量增加量；

戊巴比妥钠翻正反射试验计算大鼠的睡眠潜伏期和睡眠持续时间；

采用旷场实验方法观察失眠大鼠行为；

下丘脑中5-HT、GABA和Glu含量测定；

下丘脑组织染色，观察评价病理变化；

应用SPSS 20.0软件进行数据处理，采用Origin 2019b软件对数据进行展示，符合正态分布的数据用均值±标准差

若符合方差齐性，多组数据采用One-wayANOVA，两两比较采用LSD检验；

若方差不齐，多组间比较则采用WelchANOVA，组间比较采用Tamhane′s T2检验；p＜0.05时认为差异具有统计学意义。

进一步地，提取刺五加-树舌中的总苯丙素类成分的步骤如下：

步骤(1)刺五加茎枝粉末和树舌粉末按5︰1的质量比混合后称取3g，按料液比1︰20(g/mL)加入60mL 75％(体积)乙醇，浸泡24h；称取刺五加茎枝粉末3g，方法同上；称取树舌粉末3g，方法同上。

步骤(2)然后在80℃下回流提取90min，收集滤液；

步骤(3)重复步骤(2)两次，蒸干后，加入甲醇复溶，定容到10mL，获得刺五加-树舌粗提液、刺五加粗提液、树舌粗提液。UPLC-MS/MS分析前，用0.22μm微孔滤膜过滤；

步骤(4)重复步骤(1)提取刺五加-树舌中的苯丙素类成分，减压浓缩，将4BV2.67mg/mL刺五加-树舌粗提液加于500mL(1BV)AB-8大孔吸附树脂上，待静态吸附12h后，依次用7BV蒸馏水和7BV 30％(体积)乙醇冲洗柱子，弃去流出液，再用10BV 40％(体积)乙醇以1BV/h的流速进行洗脱，收集40％(体积)乙醇洗脱液，减压浓缩，得AGTP浸膏。

进一步地，通过公式(1)计算AGTP中所含总苯丙素的量。

公式(1)C代表洗脱液浓度,V代表洗脱液体积，m代表质量。

进一步地，使用UPLC-MS/MS技术分析刺五加与树舌配伍前后的差异成分和AGTP中的苯丙素类成分：

色谱条件：在配有Hypersil GOLD aQ色谱柱(100mm×2.1mm，1.9μm)的DionexUltimate 3000RSLC HPLC系统(Thermo Fisher Scientific，USA)进行色谱分析，流动相为0.1％甲酸水溶液(A)和0.1％甲酸-乙腈溶液(B)，梯度洗脱：0～1min，5％B；1～25min，5％～100％B；25～30min，100％B；30～31min，100％～5％B；31～35min，5％B，流速0.3mL·min

质谱条件：在配备HESI-Ⅱ型电喷雾离子源的Q Exactive Series质谱仪(ThermoFisher Scientific，USA)上进行质谱分析，在正(ESI

进一步地，按每日服用谷维素片的剂量30～90mg，结合剂量换算公式(2)，计算出AGTP各剂量组的给药剂量：

大鼠给药剂量(mg/kg)＝人的给药剂量(mg/kg)×6.3 公式(2)

进一步地，根据公式(3)计算各组大鼠体质量增加量：

体质量增加量＝给药后大鼠体质量-给药前大鼠体质量 公式(3)

进一步地，按照公式(4)和公式(5)计算大鼠的睡眠潜伏期和睡眠持续时间：

睡眠潜伏期＝入睡时间-腹腔注射时间             公式(4)

睡眠持续时间＝觉醒时间-入睡时间               公式(5)

进一步地，第6天给药30min后，进行旷场试验，测试时，实验室保持安静，室温恒定，光线均匀；将大鼠从旷场敞箱中央一格放入；待其适应2min后，用录像设备进行录制，观察并记录各组大鼠5min内穿越中央区域次数(水平运动)和站立次数(垂直运动)。

本发明利用UPLC-MS/MS技术结合质谱数据库和文献分析刺五加-树舌(5︰1)中的差异性成分，并对其进行纯化；基于UPLC-MS/MS技术分析刺五加-树舌总苯丙素提取物(AGTP)中的苯丙素类成分；应用PCPA诱导大鼠失眠模型，初步探究AGTP的镇静催眠作用及其作用机制，为后续深入研究刺五加-树舌中的总苯丙素类成分发挥镇静催眠作用的机制提供思路与方向，也为开发具有镇静催眠作用的新药提供理论依据。

为了能够更进一步了解本发明的特征及技术内容，请参阅以下有关本发明详细说明与附图，然而所附的附图仅提供参考和说明之用，并非用来对本发明加以限制。

附图说明

图1是负离子模式(A)和正离子模式(B)下供试品溶液的TIC图，Ⅰ.刺五加供试品溶液；Ⅱ.树舌供试品溶液；Ⅲ.刺五加-树舌供试品溶液；

图2是7个差异成分的结构和MS

图3是绿原酸标准曲线；

图4是PCPA对正常大鼠睡眠潜伏期(A)和睡眠持续时间(B)的影响，与空白组大鼠比较，

图5A是AGTP对失眠大鼠睡眠潜伏期的影响，图5B是AGTP对失眠大鼠睡眠持续时间的影响，与空白组比较，

图6是大鼠下丘脑切片的组织病理学观察(10×40)，黄色箭头指向正常的下丘脑神经元细胞，白色箭头指向恢复中的下丘脑神经元细胞，黑色箭头指向病变的下丘脑神经元细胞；

图7是各组大鼠下丘脑内Glu/GABA(A)、5-HT(B)、Glu(C)、GABA(D)水平的变化；与空白组比较，

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：本实施例中

仪器

UV757CRT紫外可见分光光度计     上海精密科学仪器有限公司

XSP-13C-LP生物显微镜           上海精密仪器仪表有限公司

Multiskan FC型酶标仪           赛默飞世尔(上海)仪器有限公司

试剂

材料

本实验所用的刺五加采自黑龙江省哈尔滨市方正县张广才岭和佳木斯市汤原县团结林场，树舌采自黑龙江省汤原县团结林场，经鉴定，分别为五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus(Rupr.et Maxim.)Harms.的干燥茎枝和灵芝菌科平盖灵芝Ganoderma applanatum(Pers.)Pat.的干燥子实体。

实验动物

实验动物为雄性Wistar大鼠48只，SPF级，4～6周龄，体重160～180g，由哈尔滨医科大学实验动物学部提供，生产许可证号为SCXK(黑)2019-001。严格按照实验动物要求的饲养原则，大鼠均饲养在佳木斯大学实验动物中心(环境安静，温度维持在18～22℃，湿度控制在50～60％，光照/暗循环为12h/12h)，使用许可证编号为SYXK(黑)-2021-018；饲养期间给予SPF级大小鼠维持饲料，购自沈阳市于洪区钱珉饲料有限公司，许可证号为SCXK(辽)2020-0004。大鼠适应性饲养7天，不禁食，自由饮水。所有操作均符合《实验动物管理条例》。

采用的方法

2.1样品前处理

利用粉碎机将干燥的刺五加、树舌粉碎呈粉末状，分别置于干净的聚乙烯袋中常温存放，备用。

2.2UPLC-MS/MS分析

2.2.1供试品溶液的制备

称取刺五加3g、树舌3g、刺五加-树舌(5︰1)3g，分别置于圆底烧瓶，按料液比1︰20(g/mL)加入60mL 75％乙醇，浸泡24h。以提取时间90min、提取温度80℃为条件进行回流提取，收集滤液。重复上述步骤两次，蒸干后，加入适量甲醇复溶，定容到10mL，即得刺五加供试品溶液、树舌供试品溶液、刺五加-树舌供试品溶液。进样前，用0.22μm微孔滤膜过滤。

2.2.2色谱条件

在配有Hypersil GOLD aQ色谱柱(100mm×2.1mm，1.9μm)的Dionex Ultimate3000RSLC HPLC系统(Thermo Fisher Scientific，USA)进行色谱分析。流动相为0.1％甲酸水溶液(A)和0.1％甲酸-乙腈溶液(B)，梯度洗脱：0～1min，5％B；1～25min，5％～100％B；25～30min，100％B；30～31min，100％～5％B；31～35min，5％B。流速0.3mL·min

2.2.3质谱条件

在配备HESI-Ⅱ型电喷雾离子源的Q Exactive Series质谱仪(Thermo FisherScientific，USA)上进行质谱分析。在正(ESI

2.2.4数据分析

采用Thermo Scientific Xcalibur 3.1软件处理数据。按实际测得的相对分子质量与理论相对分子质量二者偏差小于5ppm的原则，确定各色谱峰对应化合物的分子式。结合Compound Discover 2.1、MassBank、Human Metabolome Database(HMDB)、ChemSpider、PubChem等数据库和在PubMed与CNKI数据库中所检索到的相关文献，推测化学成分的结构和裂解规律。利用ChemDraw 18.1软件进行绘制成分结构。

2.3总苯丙素含量测定

2.3.1样品溶液的配制

根据“2.2.1”项下方法提取刺五加-树舌中的苯丙素类成分，浓缩，定容，获得2.67mg/mL刺五加-树舌粗提液。将4BV刺五加-树舌粗提液，加于500mL(1BV)AB-8大孔吸附树脂上，待静态吸附12h后，依次用7BV蒸馏水和7BV 30％乙醇冲洗柱子，弃去流出液，再用10BV 40％乙醇以1BV/h的流速进行洗脱，收集40％乙醇洗脱液，减压浓缩，得AGTP浸膏。取一定量AGTP浸膏溶于甲醇，即为样品溶液。进样前，用0.22μm微孔滤膜过滤。

2.3.2对照品溶液的配制

精密称取1.00mg绿原酸对照品，加适量甲醇溶解，定容至5mL，制成0.20mg/mL绿原酸对照品溶液。

2.3.3方法学考察

2.3.3.1线性关系

精密移取绿原酸对照品溶液，分别加甲醇稀释成0.0080、0.0120、0.0160、0.0200、0.0240mg/mL系列对照品溶液，以甲醇为参比，于280nm处测定吸光度。以绿原酸对照品浓度为横坐标(X)，吸光度值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。

2.3.3.2精密度

移取0.0160mg/mL对照品溶液，按“2.3.3.1”项下方法连续测定6次，记录吸光度。

2.3.3.3稳定性

称取3.6g刺五加-树舌，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12h按“2.3.3.1”项下方法测定吸光度。

2.3.3.4重复性

称取6份3.6g刺五加-树舌，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3.1”项下方法测定吸光度。

2.3.4样品含量测定

移取“2.3.1”项下适量样品溶液，按“2.3.3.1”项下方法测量吸光度值，并通过公式(1)计算AGTP中所含总苯丙素的量。

2.4AGTP的镇静催眠作用研究

2.4.1AGTP混悬液的制备

移取一定量“2.3.1”项下AGTP浸膏，加生理盐水复溶，得4.26mg/mLAGTP混悬液。2.4.2PCPA混悬液的配制

称取5.0g PCPA粉末，加适量生理盐水定容至50mL，制得100.0mg/mL PCPA混悬液。

2.4.3地西泮溶液的配制

将4mLDZP注射液(规格：2mL/10mg)溶于适量生理盐水，得2.0mg/mL DZP溶液。2.4.4戊巴比妥钠溶液的配制

将0.75g戊巴比妥钠溶于适量生理盐水，配得15.00mg/mL戊巴比妥钠溶液。

2.4.5复制失眠模型

将Wistar大鼠随机分为空白组(6只)和造模组(42只)。造模组大鼠以300mg/kg给药剂量腹腔注射(i.p.)PCPA混悬液，于每日上午8:30～9:00进行，连续注射3天。每次注射结束后，均用75％乙醇擦拭伤口，避免感染。空白组大鼠i.p.等量生理盐水。

2.4.6分组及给药

由于未曾有文献对AGTP的给药剂量进行研究，故本章选取市售非处方药中结构归属苯丙素类化合物且具有镇静助眠功效的谷维素片作为参考。根据成人每日服用谷维素片的剂量30～90mg，结合剂量换算公式(2)，计算出AGTP各剂量组的给药剂量。

大鼠给药剂量(mg/kg)＝人的给药剂量(mg/kg)×6.3 公式(2)

将造模成功的失眠大鼠，随机分为模型组(n＝6)、DZP组(n＝6，4.0mg/kg)、AGTP高剂量组(AGTP-H，n＝7，9.45mg/kg)、AGTP中剂量组(AGTP-M，n＝7，6.30mg/kg)、AGTP低剂量组(AGTP-L，n＝7，3.15mg/kg)。空白组和模型组给予等体积生理盐水(1mL/100g)，其余组给予相应样品溶液，于每日上午8:30～9:30灌胃给药，每天1次，连续7天。

2.4.7大鼠一般状态观察

造模和药物干预后，观察各组大鼠的精神状态、毛发光泽变化、对外界刺激的反应等。记录各组大鼠给药前后体质量，并根据公式(3)计算各组大鼠体质量增加量。

体质量增加量＝给药后大鼠体质量-给药前大鼠体质量 公式(3)2.4.8戊巴比妥钠翻正反射试验

分别于第3次i.p.PCPA 12h后和末次给药30min后，给药剂量40mg/kg，对各组大鼠进行i.p.戊巴比妥钠溶液。观察并记录各组大鼠的腹腔注射时间、入睡时间和觉醒时间。入睡时间是以1min内翻正反射消失为标准，觉醒时间是以30s内翻正反射恢复为标准。按照公式(4)和公式(5)计算大鼠的睡眠潜伏期和睡眠持续时间。

睡眠潜伏期＝入睡时间-腹腔注射时间             公式(4)

睡眠持续时间＝觉醒时间-入睡时间               公式(5)2.4.9旷场实验

第6天给药30min后，进行旷场试验。测试时，实验室保持安静，室温恒定，光线均匀。将大鼠从旷场敞箱(85cm×85cm×85cm，箱底用白线等分为25个17cm×17cm正方形格子。)中央一格放入。待其适应2min后，用录像设备进行录制，观察并记录各组大鼠5min内穿越中央区域次数(水平运动)和站立次数(垂直运动)。每次试验结束后，清洁，并喷洒75％酒精去除异味，以免影响下一只鼠的行为。

2.4.10大鼠下丘脑中5-HT、GABA和Glu含量测定

末次给药1h后，在戊巴比妥钠深度麻醉下处死所有大鼠，收集大鼠全脑。将脑组织置于冰盘中分离出下丘脑。将下丘脑和生理盐水在冰浴条件下匀浆，于4℃、12000r/min条件下离心10min，获得下丘脑匀浆液。采用酶联免疫吸附法严格按照相应试剂盒说明书进行操作，测定各组大鼠下丘脑中5-HT、GABA、Glu的含量。

2.4.11H&E染色

将下丘脑浸泡在10％中性福尔马林缓冲溶液中固定。固定后，脱水、浸蜡、切片、脱蜡、染色、封片，在显微镜下观察评价病理变化。

2.4.12统计学分析

应用SPSS 20.0软件进行数据处理，采用Origin 2019b软件对数据进行展示。符合正态分布的数据用均值±标准差

3结果

3.1差异成分的鉴定

取刺五加、树舌和刺五加-树舌供试品溶液，按“2.2”项下色谱、质谱条件进行分析，分别得到正、负离子模式下总离子流图(TIC)、刺五加-树舌中差异成分的结构和MS图，见图1和图2。

通过Thermo Scientific Xcalibur 3.1软件结合二级质谱(MS

表1刺五加-树舌中差异成分的质谱信息

3.2总苯丙素含量测定结果

3.2.1方法学考察结果

绿原酸浓度与吸光度的线性关系见图3。如图3所示，线性回归方程为Y＝30.711X+0.042(r＝0.9967)，说明绿原酸在0.0040～0.0240mg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。日内精密度、稳定性、重复性的RSD(n＝6)值分别是0.15％、1.01％、1.63％，表明该含量测定方法可行。

3.2.2AGTP含量测定

由表2可知，AGTP中总苯丙素含量由25.41％提高到51.77％，是纯化前的刺五加-树舌粗提液的2.0倍，RSD值为1.52％。说明该纯化方法简便、可重复操作。

表2验证性试验数据

3.3AGTP中苯丙素类成分的鉴定

按照上述色谱和质谱条件进行成分检测，结合质谱数据库和文献，共鉴定出38个苯丙素类成分，具体信息如表3所示。

表3AGTP中苯丙素类成分鉴定分析

3.4动物实验验证结果

3.4.1各组大鼠的一般状态

造模前，大鼠整体精神状态良好，反应敏捷，毛发有光泽，昼夜节律规律，不易受外界刺激而恐慌，无打架攻击行为。造模后，造模组大鼠具有一定的兴奋性，昼夜节律紊乱，白天活动增加，毛发干枯、无光泽且易脱落，对外界刺激敏感，具有攻击性，消瘦。给予药物治疗后，与模型组比较，DZP组和各剂量组大鼠的一般状态均有不同程度地改善，其中以DZP组和AGTP-H组大鼠恢复效果最佳。

3.4.2大鼠体重变化

给药前，与空白组比较，各组大鼠体质量均显著下降(p＜0.01)；除空白组外，其余各组大鼠之间体质量均差异不显著(p＞0.05)。说明PCPA可抑制正常大鼠体质量的增加，在一定程度上表明成功复制失眠模型。

给药后，与空白组比较，模型组大鼠体质量和体质量增加量均显著下降(p＜0.001)，在一定程度上表明PCPA诱导的失眠模型至少可持续7天；与模型组比较，给予AGTP和DZP后，AGTP-H和DZP三组大鼠的体质量(p＜0.01)及其增加量(p＜0.001)均显著增加，AGTP-M组大鼠的体质量及其增加量均明显增加(p＜0.05)，表明高中剂量AGTP和DZP对失眠导致的机体消耗有明显的改善作用。而AGTP-L组体质量及其增加量均有增加，且无显著性差异(p＞0.05)，说明AGTP-L对失眠导致的机体消耗有一定的缓解作用。结果见表4。

表4各组大鼠给药前后体质量及其增加量的比较(x±s)

注：与空白组比较，

3.4.3戊巴比妥钠翻正反射试验结果

3.4.3.1PCPA对大鼠睡眠潜伏期和睡眠持续时间的影响

造模后，与空白组大鼠相比较，造模组大鼠的睡眠潜伏期显著延长(p＜0.001，图4-A)，睡眠持续时间显著缩短(p＜0.01，图4-B)，表明成功复制失眠模型，共有39只失眠大鼠。3.4.3.2刺五加-树舌总苯丙素对失眠大鼠睡眠潜伏期和睡眠持续时间的影响

睡眠质量的评价主要是通过睡眠潜伏期和睡眠持续时间来判断。戊巴比妥钠翻正反射试验是目前药理学研究中常用于评价药物是否具有镇静催眠作用的药理试验方法。给药后，与空白组比较，模型组大鼠睡眠潜伏期明显延长(p＜0.05，图5-A)，睡眠持续时间显著缩短(p＜0.01，图5-B)，表明PCPA诱导的失眠大鼠模型至少可持续7天，与文献记载相符。与模型组比较，给予药物AGTP-H和DZP的两组大鼠的睡眠潜伏期均明显缩短(p＜0.05)，睡眠持续时间显著延长(p＜0.01)，已基本恢复至正常大鼠水平；AGTP-M组和AGTP-L组大鼠的睡眠潜伏期和睡眠持续时间均有所恢复(p＞0.05)，说明AGTP-H对失眠的睡眠情况具有治疗作用，中低剂量的AGTP则具有一定的改善作用，表明AGTP对失眠的治疗效果存在一定的剂量依赖性。与DZP组比较，AGTP-H组2个检测指标的差异均不具显著性(p＞0.05)；AGTP-M组和AGTP-L组2个检测指标均有差异，且差异具有显著性(p＜0.05)。表明高剂量的AGTP对失眠的治疗作用与地西泮(DZP)相近。

3.4.4旷场实验结果

旷场实验是检测动物情绪行为和自发活动情况的经典实验。其中大鼠的自发活动情况是通过穿越中央区域次数和站立次数反映。采用旷场实验方法观察AGTP对失眠大鼠行为的影响，结果如表5所示。与空白组相比，模型组大鼠穿越中央区域次数(p＜0.01)和站立次数(p＜0.001)均显著降低，说明失眠大鼠自发活动减少，警觉性较高，出现郁郁寡欢、喜静少动、紧张等负面情绪；与模型组相比，AGTP-H组和DZP组均能显著增加大鼠的穿越中央区域次数(p＜0.01)和站立次数(p＜0.001)；AGTP-M组和AGTP-L组大鼠在穿越中央区域次数和站立次数上均高于模型组。说明AGTP能缓解失眠大鼠的负面情绪，降低警觉性，还对失眠大鼠在自发活动和空间探索能力和兴趣方面具有促进作用。表明AGTP-M和AGTP-L均有镇静作用，其中AGTP-H的镇静作用最强。

表5给药后大鼠旷场实验结果

注：与空白组比较，

3.4.5下丘脑组织病理学观察

各组大鼠下丘脑组织切片的病理学变化如图6所示。空白组大鼠下丘脑神经元细胞形态正常，结构完整，细胞界限清晰，细胞核居中且不固缩，细胞质染色深，细胞质内尼氏体均匀分布。与空白组相比，模型组细胞形态不规则，细胞界限模糊，细胞核偏移且固缩，细胞质染色浅，观察不到尼氏体。可能是失眠大鼠下丘脑内Glu含量升高所致，因为过量的Glu具有神经兴奋性毒性，会对大脑神经元细胞造成损伤，包括下丘脑和海马体中的神经元。与模型组相比，AGTP-H组和DZP组大部分细胞核偏移且固缩的细胞已恢复正常，细胞质深染，可见尼氏体，但仍存在少量细胞界限模糊的神经元细胞，病理变化与文献报道一致；AGTP-M组较多神经元细胞的细胞核居中且不固缩，也有部分细胞界限不清、细胞核偏移但不固缩的细胞；AGTP-L组部分神经元细胞的细胞核偏移但不固缩，其余特征与模型组相似。

综上，给予AGTP后，失眠大鼠脑组织病理状态得到不同程度的好转，表明AGTP可改善和修复PCPA致失眠大鼠脑组织神经元细胞的损伤，且呈现剂量依赖性。AGTP-H改善和修复PCPA致失眠大鼠脑组织神经元细胞损伤的作用最强。

3.4.6大鼠下丘脑内5-HT、Glu、GABA水平的变化

AGTP对PCPA致失眠大鼠下丘脑内神经递质水平的影响，如图7所示。脑内5-HT神经元可通过5-HT

根据前期网络药理学分析结果，结合失眠发病机制的相关研究，说明AGTP具有调节5-HT、Glu、GABA表达的潜在可能。与空白组比较，模型组大鼠下丘脑内5-HT(p＜0.05)和GABA含量(p＜0.01)均明显减少，Glu含量(p＜0.05)和Glu/GABA比值(p＜0.01)均明显增加，表明PCPA可抑制下丘脑中5-HT的产生，进而影响Glu和GABA的生成，从而打破二者平衡，几乎达到完全失眠的状态。与模型组比较，AGTP-H组和DZP组的4个指标均具有极显著性(p＜0.01)；AGTP-M和AGTP-L组的5-HT、Glu、GABA含量和Glu/GABA比值均有恢复且优于模型组，其中，AGTP-M组的Glu、GABA含量和Glu/GABA比值的3个指标具有显著性差异(p＜0.05)，说明AGTP具有镇静催眠作用，并具有一定的剂量依赖性，以高剂量效果最佳。与DZP组比较，AGTP-H组和AGTP-M组的4个指标均无显著性差异(p＞0.05)；AGTP-L组的4个指标均具有显著性差异(p＜0.05)，说明高剂量AGTP的疗效与地西泮(DZP)相近。综上，AGTP治疗失眠可能是通过调节抑制性和兴奋性神经递质的含量来实现的。

本申请采用UPLC-MS/MS技术分别对刺五加-树舌、刺五加和树舌供试品溶液进行差异成分分析。结果发现刺五加-树舌配伍与单味药相比，ESI

PCPA致失眠大鼠的昼夜节律紊乱；给予AGTP后，失眠大鼠的睡眠潜伏期明显缩短，睡眠持续时间显著延长，自发活动增加，说明AGTP能改善失眠的睡眠状态，缓解负面情绪，还能对其在自发活动和空间探索能力与兴趣方面具有促进作用，表明AGTP具有镇静催眠作用；与此同时，AGTP-H组的两项实验数据均与阳性药DZP相近(p＞0.05)，表明高剂量的AGTP的镇静催眠疗效与地西泮(DZP)相近。

5-HT是一种通过与下丘脑中5-HT受体结合影响下丘脑高级中枢，调节睡眠和唤醒的单胺类神经递质。GABA和Glu是中枢神经系统中与睡眠相关的主要调节神经递质，分别是抑制性和兴奋性神经递质。GABA由Glu脱羧生成，但Glu多属中间产物，只有少数Glu起到神经递质的作用，而Glu/GABA的比值维持着神经细胞抑制和兴奋之间的平衡，因此常被用于研究和评估中枢神经系统兴奋和抑制状态。大鼠经PCPA诱导后，可引起神经递质分泌紊乱；经AGTP治疗后，5-HT和GABA含量均有所增加，Glu含量显著降低，使得Glu/GABA比值显著下降，表明AGTP对PCPA致失眠大鼠具有治疗作用，其机制可能是通过调节下丘脑中的神经递质5-HT、GABA、Glu含量，使得Glu/GABA比值处于动态平衡，达到镇静催眠的效果，初步验证AGTP发挥镇静催眠药效的作用机制。本发明通过细胞水平、Western Blot、免疫组化等手段进一步探讨AGTP的作用靶点及其机制，为AGTP的临床用药提供科学依据。