重金属镉亚慢性暴露诱发小鼠肺纤维化模型的构建方法

摘要

本发明公开重金属镉亚慢性暴露诱发小鼠肺纤维化模型的构建方法，涉及动物模型制备技术领域。本发明通过将小鼠在恒温和恒湿的鼠房中适应性喂养一周，自由进食和饮水，保持鼠房中每间隔12h的昼夜交替；让小鼠通过雾化器吸入氯化镉，每次雾化吸入氯化镉2h，间隔一天一次，持续10周，完成重金属镉亚慢性暴露诱发小鼠肺纤维化模型。本发明构建过程及方法简单实用，适用于探究环境因素暴露诱发小鼠肺纤维化模型，我们的结果为研究环境因素暴露诱发小鼠肺纤维化模型提供了实验室证据，为将来关注环境因素暴露损伤呼吸系统健康效应提供了依据，为预防和治疗环境因素暴露诱发肺纤维化提供了研究方向和靶点，可以进一步研究推广使用。

说明书

技术领域

本发明涉及动物模型制备技术领域，涉及重金属镉亚慢性暴露诱发小鼠肺纤维化模型的构建方法。

背景技术

肺纤维化是一种以成纤维细胞广泛增殖和细胞外基质沉积为特征的间质性肺疾病，以纤维母细胞灶、肺泡蜂窝状、持续性纤维化为主要特征，是导致肺组织结构破坏，引起爆发性呼吸衰竭的渐进性、致命性间质性肺部疾病。肺纤维化的主要危险因素包括年龄、吸烟及环境污染等。肺纤维化的临床表现是持续性干咳和急性呼吸困难，伴随肺损伤的加剧，患者的肺功能持续下降，导致死亡。近年来，国内外肺纤维化的发病率呈上升趋势，随着年龄的增长，肺纤维化的患病率也在增加，因此，研究肺纤维化疾病的进展机制尤为重要。

动物疾病模型主要用于实验生理学、实验病理学和实验治疗学研究。由于临床积累的经验不仅在时间和空间上都存在局限性，而且许多实验在道义上和方法上也受到限制。而借助于动物模型的间接研究，可以有意识地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素，以便更准确地观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究。

针对肺纤维化的小鼠模型，目前各研究单位均有研究先例，通过博来霉素、石棉、二氧化硅和异硫氰酸荧光素等试剂进行造模用于动物实验研究，现有技术的研究，主要针对药物或内源性因素所诱发的小鼠肺纤维化模型，而针环境因素——重金属镉暴露诱发小鼠肺纤维化模型未见报道。目前肺纤维化传统的病因因素并不能很好的解释越来越高的发病率和死亡风险，而空气污染的加剧以及生态环境的恶化，对于呼吸系统疾病的影响越来越明显，前期的流行病学证据提示重金属镉暴露可能诱发多种呼吸系统疾病，但是重金属镉暴露与肺纤维化之间的关联一直不清楚。

因此，本发明旨在提供一种重金属镉亚慢性暴露诱发小鼠肺纤维化模型的构建方法。

发明内容

本发明的目的在于，提供重金属镉亚慢性暴露诱发小鼠肺纤维化模型的构建方法，以重金属镉亚慢性暴露诱发小鼠肺纤维化模型，用于肺纤维化相关研究。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：

重金属镉亚慢性暴露诱发小鼠肺纤维化模型的构建方法，包括以下步骤：

S1：小鼠模型构建前预处理

将小鼠在恒温和恒湿的鼠房中适应性喂养一周，自由进食和饮水，保持鼠房中每间隔12h的昼夜交替；

S2：小鼠肺纤维化的诱发

让小鼠通过雾化器吸入氯化镉，每次雾化吸入氯化镉2h，间隔一天一次，持续10周，完成以重金属镉亚慢性暴露诱发小鼠肺纤维化模型构建。

进一步的，所述鼠房的恒温为25～28℃，恒湿为50±5％。

进一步的，所述小鼠通过雾化器吸入氯化镉采用鱼跃牌雾化器，氯化镉为0.1mg/mL。

进一步的，所述小鼠选体重22～24g的8周龄C57BL/6雄性小鼠。

本发明的另一目的在于，提供重金属镉亚慢性暴露诱发小鼠肺纤维化模型的构建方法在小鼠肺纤维化模型构建中的应用。

本发明的另一目的在于，提供重金属镉亚慢性暴露诱发小鼠肺纤维化模型的构建方法构建的肺纤维化小鼠模型在肺纤维化研究中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明以重金属镉亚慢性暴露诱发小鼠肺纤维化模型，采用氯化镉对小鼠进行雾化吸入制备，小鼠肺纤维化模型效果好，构建过程及方法简单实用，适用于探究环境因素暴露诱发小鼠肺纤维化模型，我们的结果为研究环境因素暴露诱发小鼠肺纤维化模型提供了实验室证据，为将来关注环境因素暴露损伤呼吸系统健康效应提供了依据，为预防和治疗环境因素暴露诱发肺纤维化提供了研究方向和靶点，可以进一步研究推广使用。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

图1为本发明实施例所述镉慢性暴露诱发小鼠肺纤维化；

图2为本发明实施例所述镉慢性暴露诱发小鼠肺EMT；

图3为本发明实施例所述镉慢性暴露诱发小鼠肺FMT；

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将结合附图对实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

重金属镉亚慢性暴露诱发小鼠肺纤维化模型的构建方法及对照实验设计：

购买8周龄C57BL/6雄性小鼠，体重约为22g～24g，所有小鼠在一个恒温(25～28℃)和恒湿(50±5％)的鼠房中适应性喂养一周，自由进食和饮水，保持鼠房中每间隔12h的昼夜交替。

本实施例中，将所有小鼠随机分为正常对照组和模型组，模型组小鼠使用鱼跃牌雾化器吸入氯化镉(CdCl2，0.1mg/mL，购自Sigma-Aldrich公司)，每次雾化吸入氯化镉2h，间隔一天一次，持续10周；正常对照组给予纯净水雾化暴露。

暴露10周之后，取部分小鼠，检测小鼠肺功能水平，结果发现镉暴露组小鼠肺功能指标：最小肺动态顺应性(minimumvalueoflungdynamiccompliance,Cydn-min)显著降低，吸气阻力(inspiratoryresistance，Ri)和呼气阻力(expiratory resistance，Re)显著升高。

基于上述实施例重金属镉亚慢性暴露诱发的小鼠肺纤维化模型，取上述实施例中剩余的小鼠；麻醉之后，摘眼球取血，颈椎脱臼处死小鼠，收集小鼠肺组织，进行称重；取部分小鼠肺组织进行福尔马林固定，石蜡包埋切片，进行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosinstaining，HE)；

结果发现：与正常对照组相比，镉暴露组小鼠体重降低，小鼠肺重和肺系数显著升高；此外，HE染色结果发现：镉暴露组小鼠肺泡破坏指数(destructive index)、平均肺泡截距(meanlinearintercept)、病理学评分(pathologicalscore)、气道壁厚度(airwaywallthickness)、炎性细胞数(inflammatorycell)、病理学评分(pathologicalscore)显著升高，而气道壁面积(airwaywallarea)显著降低；马松染色及天狼星红染色可见镉暴露组小鼠肺胶原沉积显著增多，免疫组化染色发现镉暴露组小鼠肺α-SMA阳性细胞数和胶原蛋白表达升高。

实施例2

重金属镉慢性暴露诱发小鼠肺上皮间质转化(Epithelial-mesenchymaltransition,EMT)的实验设计：

基于上述实施例重金属镉亚慢性暴露诱发的小鼠肺纤维化模型，取上述实施例中剩余的小鼠肺组织，通过蛋白免疫印迹的方式检测EMT相关指标的表达，结果发现：镉慢性暴露之后，显著升高肺泡上皮细胞间质标志N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达水平，抑制了上皮标志E-钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白表达。上述实验表明：慢性镉暴露诱发肺泡上皮细胞EMT。

实施例3

重金属镉慢重金属镉慢性暴露诱发小鼠肺成纤维细胞向肌成纤维肌细胞分化(fibroblast-to-myofibroblasttransition，FMT)的实验设计：

基于上述实施例重金属镉亚慢性暴露诱发的小鼠肺纤维化模型，取上述实施例中剩余的小鼠肺组织，通过蛋白免疫印迹的方式检测小鼠肺FMT标志物的水平，结果发现镉慢性暴露提高了成纤维细胞激活相关标志蛋白，如结缔组织生长因子(CTGF)、胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤连蛋白(Fibronectin)表达水平。上述体内实验表明：慢性镉暴露诱发肺成纤维化细胞FMT。

如图1中，图注：(A)小鼠肺HE染色；(B)小鼠肺重；(C)小鼠肺系数；(D)肺泡破坏指数；(E)肺病理评分；(F)平均肺泡截距；(G)肺气道壁厚度；(H)肺气道面积；(I)最小肺动态顺应性；(J)吸气阻力；(K)呼气阻力；(L)肺天狼星红染色代表性图片；(M)胶原细胞定量；(N)肺马松染色代表性图片；(O)胶原细胞定量；(P)肺α-SMA免疫组化染色代表性图片；(Q)α-SMA阳性细胞数定量；(R)Collagen免疫组化染色代表性图片；(S)Collagen阳性细胞数定量。所有数据以均值±标准误表示(N＝12).*P<0.05,**P<0.01.

如图2中，(A)小鼠肺EMT相关标志蛋白免疫印迹代表性图片；(B)E-cadherin蛋白定量；(C)N-cadherin蛋白定量；(D)Vimentin蛋白定量。所有数据以均值±标准误表示(N＝6).*P<0.05,**P<0.01.

如图3中，(A)小鼠肺FMT相关标志蛋白免疫印迹代表性图片；(B)CTGF蛋白定量；(C)CollagenⅠ蛋白定量；(D)α-SMA蛋白定量；(E)Fibronectin蛋白定量。所有数据以均值±标准误表示(N＝6).*P<0.05,**P<0.01.

综上所述，以上体内外实验结果表明：镉亚慢性暴露诱发小鼠肺损伤、胶原沉积和肺功能降低，引起肺泡上皮细胞EMT和肺成纤维细胞FMT，表明亚慢性镉暴露成功诱发小鼠肺纤维化模型。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。